磷脂酰丝氨酸复合胶囊辅助改善记忆功能研究

陈頔 朴玮 黄建

摘 要：目的：观察磷脂酰丝氨酸复合胶囊对改善小鼠及人体学习记忆功能的影响。方法：动物实验部分，昆明种雌性小鼠随机分为低、中、高 3 个剂量组（剂量分别为 333、667、1 000mg/kg·BW）和阴性对照组，每组共计12只，每48只1个大组进行行为学实验。连续灌胃给药 30d 后，分别进行水迷宫、跳台和避暗实验。1周后，小鼠按照相同的数量和方法重复上述实验;人体实验部分，选取49～65岁且知情同意的健康退休人员随机分为试食和对照组作为研究对象，试食组57人、对照组59人，服用30d，对照组服用相同外观的软胶囊安慰剂。实验开始及结束时采用中国科学院心理研究所编制的临床记忆量表测量评估，将各分测验量表得分和记忆商进行前后和平行比较。结果：磷脂丝氨酸复合胶囊可延长小鼠跳台实验的测验潜伏期、减少跳台训练错误次数;小鼠避暗消退实验的潜伏期延长，差异均具有显著性意义（P<0.05）。重复实验也为阳性;试食组57人服用磷脂酰丝氨酸复合胶囊后，各分测量量表得分及记忆商与实验前比较均有明显的提高，差异具有显著性（P<0.05），与对照组比较，试食组各分测验量表分（除指向记忆）均有所提高，差异具有统计意义（P<0.05）。总量表分和记忆商试食组试食前后差异显著，试食后均显著提高（P<0.05）。结论：磷脂酰丝氨酸复合胶囊具有辅助改善小鼠及人体学习记忆功能的作用。

关键词：磷脂酰丝氨酸;行为实验;学习记忆;临床记忆量表

神经系统的退行性病变以主要症状为智力、记忆力语言思维能力不可逆的进行性退化的阿尔茨海默症最为明显。本研究复合配方由磷脂酰丝氨酸（PS）、藻油DHA、牛磺酸和锌等有效成分构成。DHA主要来源于海洋和淡水微藻的多不饱和脂肪酸，其在大脑神经发育和学习记忆方面起着重要作用[1]。PS作为磷脂家族中的一员，是唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能状态的磷脂[2]，具有改善、修复大脑损伤等功能，成为“脑专一性营养物质”[3]。作为 2010年10月第15号公告国家批准的新资源食品，PS不仅对生理性、损伤性人群的认知能力恢复具有显著、积极的效应，在非损伤性认知能力下降的人群研究中被证明也具有提高认知力的作用[4]。唐勇等[5]在强化PS纯牛奶改善记忆力人群试食研究中发现，每天给予高中生100mg PS强化的牛奶 250mL 40d后，其记忆力显著提高。李阅兵等[6]在综述中阐明，DHA能够促进PS的积累。Chen 等[7]研究了牛磺酸对敲除蛋氨酸硫化物还原酶-A 基因小鼠的抗氧化應激作用，结果表明，牛磺酸可显著降低心肌线粒体的蛋白氧化水平，提高基因敲除小鼠的抗氧化应激能力;锌是体内不可缺少的微量元素，与脑的发育、脑功能及行为密切相关，作为基因表达、组织修复以及记忆形成等生物学过程的重要介质，近年来的研究显示，在脑、神经元、脊髓和神经节等的神经元轴突终末的突触小泡中富含大量的锌离子[8]。

本研究按照PS每日摄入量160mg、DHA 80mg、牛磺酸240mg、锌11.2mg的人体配方，参照2012版《保健食品检验与评价技术规范》中辅助改善记忆方法进行动物和人体实验，观察PS复合胶囊在改善学习记忆中的功效，进一步观察四种有效成分复合在一起的整体效果，旨在充分研究和评估该受试物在改善记忆功能方面的复合作用和效果。

1 材料与方法

1.1 受试样品

PS复合胶囊，内容物为类白色颗粒。胶囊规格：0.5g/粒*60粒/瓶，人体推荐量2.0g/d（2 000mg/60kg·BW）。其标志性有效成分及含量为每100g中含有PS 8.0g、DHA 4.0g、牛磺酸12.0g、锌0.56g。

1.2 实验动物和人体受试者

1.2.1 实验动物 第1次实验：选用中国食品药品检定研究院提供的SPF级雌性昆明小鼠144只，18～22个，许可证号为SCXK（京）2014-0013。小鼠饲养于实验室清洁级动物房，自由饮水。重复实验：所选小鼠品系，克数、饲养地点、级别等基本情况均与第1次相同。

1.2.2 人体受试者纳入标准 本研究所有受试者均同意并签署知情同意书。年龄在49～65岁之间，身体健康，无智力障碍，未接受过类似测试且排除短期内服用与受试功能有关的物品;体质虚弱无法接受实验合并有严重全身性疾病患者除外。

1.3 实验剂量分组选择与受试物给予方式

1.3.1 动物分组与受试方式 该评价实验共分为3个行为学实验，每个实验均将雌性昆明小鼠以人体每日推荐量的10、20、30倍，设低、中、高等3个剂量组（333、667、1 000mg/kg·BW）和1个随机对照组，每小组12只，每个行为学实验共48只。用蒸馏水将受试物配至所需浓度，灌胃量为10mL/kg·BW，每日1次，连续灌胃30d，对照组灌胃等体积蒸馏水。每周称小鼠体重2次。

1.3.2 人体分组与受试物使用方法 服样前对受试者进行第1次记忆商测试后，按记忆商随机分为试食和对照组，试食组按受试样品的推荐剂量和方法服用，每日2次，每次2粒，口服30d。对照组服用安慰剂（不含有效成分但外形相同的胶囊）。按双盲法进行试食实验，方法及剂量与试食组相同。

1.4 实验主要仪器与材料

1.4.1 动物实验仪器 小鼠跳台仪、小鼠避暗仪、LW-1小鼠水迷宫仪。

1.4.2 人体实验材料与仪器 临床记忆量表测试相关磁带及图片材料、录音机、秒表。

1.5 动物实验方法

1.5.1 跳台实验 连续灌胃30d后进行跳台实验，次日开始训练。将动物放入反应箱内适应3min，立即通以36V交流电刺激小鼠。然后将小鼠放在绝缘平台上，记录各小鼠第1次跳下平台的潜伏期、5min内每只鼠受到电击的次数（跳下平台的错误次数）和各组跳下平台的动物数，以此作为学习成绩。24h后重复测试，记录第1次跳下平台的潜伏期、3min内跳下平台的错误次数和各组跳下平台的动物数。停止给予受试物继续饲养，3d后进行消退实验。

1.5.2 避暗实验 末次给受试物后次日开始训练，记录每只鼠从放入明室至进入暗室遭电击所需的时间（潜伏期）、5min内进入暗室的错误次数和各组进入暗室的动物数。24h后同一时间点再进行测验，记录每鼠进入暗室的潜伏期、5min内进入暗室的错误次数和各组进入暗室的动物数。停止给予受试物继续饲养，3d后进行消退实验。

1.5.3 水迷宫实验 末次给样后次日开始训练，训练期间继续给予受试物。每天训练1次，连续5d。小鼠训练时间限定为120s，在120s内未到达终点的小鼠均记为120s。最后以5d的总学习成绩进行评价，计算各组5d到达终点的总时间、总错误次数和各组2min内到达终点的动物数。停止给予受试物继续饲养，7d后进行消退实验。

1.6 人体实验方法和观察指标

1.6.1 安全性指标 一般状况（精神、睡眠、饮食、大小便、血压等）。血、尿常规检查、肝、肾功能检查等其他基本生化指标。胸透、心电图、腹部B超检查（此项且仅实验前检查1次）。

1.6.2 功效性指标 临床记忆量表评估内容包括指向记忆、联想学习、图象自由回忆、无意义图形再认和人像特点联系回忆量表分。用测试后的各分测验原始分查量表分，各分测验量表分相加得总量表分，用总量表分查记忆商。

1.7 实验数据统计

动物和人体实验均使用SPSS软件统计处理，且以均数±标准差（X±SD）表示。动物实验计量资料采用方差分析，进行方差齐性检验，用多个实验组和1个对照组间均数的两两比较方法进行统计。计数资料采用卡方检验;人体实验数据为计量资料，对两组各分测验量表分和记忆商可用t检验进行分析。自身对照可以采用配对t检验，组间平行比较采用两样本均数的t检验。

2 结果与分析

2.1 动物实验结果

2.1.1 磷脂酰丝氨酸复合胶囊对小鼠的影响——跳台实验 由表1可见，第1次实验，667 mg/kg·BW剂量组跳台测验潜伏期105.3s，较对照组51.3s的潜伏期显著延长，1 000mg/kg·BW剂量组小鼠跳台消退实验潜伏期较对照组显著延长41.7s，1 000mg/kg·BW剂量组训练错误次数明显减少1.5次，667、1 000mg/kg·BW剂量组跳台测验错误次数明显低于对照组，667、1 000mg/kg·BW剂量组测验跳下平臺的错误反应率明显下降，差异均具有统计学意义（P<0.05）;重复实验中，333 mg/kg·BW剂量组跳台训练潜伏期与1 000 mg/kg·BW剂量组跳台测验潜伏期与对照组比较显著延长了35.2s和42.4s，差异具有显著性（P<0.05）。333mg/kg·BW剂量组跳台训练错误次数与333mg/kg·BW剂量组跳台消退实验错误次数分别明显减少了1.1、1.0次，差异具有显著性（P<0.05）。333、1 000mg/kgBW剂量组消退实验跳下平台的错误反应率与对照组比较下降了58.3%和41.7%，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.1.2 磷脂酰丝氨酸复合胶囊对小鼠的影响—避暗实验 由表2可见，第1次实验，333、1 000mg/kg·BW剂量组避暗测验潜伏期较对照组变长63.8s和56.5s，333mg/kg·BW剂量组避暗消退实验小鼠进入暗室的潜伏期显著增长48.3s，333、667mg/kg·BW剂量组进入暗室的错误次数明显减少，差异具有统计学意义（P<0.05）;重复实验中，1 000mg/kg·BW剂量组避暗测试错误次数明显减少0.7次，1 000mg/kg·BW剂量组测试进入暗室的错误反应率明显下降66.7%，1 000mg/kg·BW剂量组避暗消退实验小鼠进入暗室的潜伏期明显增长，差异均具有显著性（P<0.05）。

2.1.3 磷脂酰丝氨酸复合胶囊对小鼠的影响—水迷宫实验 由表3可见，第1次实验，各剂量组小鼠在记忆获得和记忆消退阶段到达终点前的时间、到达终点前的错误次数和2min内到达终点的动物百分率与对照组比较，差异均无显著性（P>0.05）;重复实验结果与第1次结果完全一致，水迷宫实验该项结果判定为阴性。

2.2 人体实验结果

2.2.1 一般状况 本实验纳入受试者120例，试食对照组各60例。试食组脱失受试者3例、对照组脱失受试者1例。有效受试者116例。试食组、对照组受试者脱失率分别为5.0%、1.7%。试食期间未见对人体安全指标产生不良和过敏反应，精神、睡眠、饮食、大小便等无明显变化。受试者实验前胸透、心电图、腹部B超等检查，均在正常范围。试食前后血、尿、便常规及血生化各项指标均在正常范围。试食前两组患者年龄、性别以及文化水平差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2.2 对功效指标的影响

（1）试食前后两组记忆量表得分情况：试食组与对照组比较，试食前，各指标均无统计学差异（P>0.05），试食后，除指向记忆外，联想学习、图象自由回忆、无意义图形再认和人像特点联系回忆得分均升高（P<0.01）;试食前后比较，对照组各指标均无统计学差异（P>0.05）。试食组各量表得分均显著增加（P<0.01）（表4）。（2）总量表分和记忆商比较：试食组自身比较以及试食后与对照组比较，总量表分和记忆商均显著增加（P<0.01）（表5）。

3 讨论

学习记忆的行为学方法中最经典的实验方法包括：经典条件反射、回避性条件发射（被动和主动回避性）、操作式学习和辨别性学习[9]。每一种习得性行为都包括学习和记忆过程，跳台、避暗和水迷宫实验都是通过观察对记忆获得、巩固、再现的影响来观察受试物对记忆各过程的影响效果。动物实验小鼠在跳台和避暗实验中的阳性结果表明，PS复合胶囊能够有效地改善小鼠的学习记忆能力。

临床记忆量表是一种比较客观地测量记忆水平的临床检测工具[10]。本研究的人体实验部分，试食组试食前后各量表得分、总量表分和记忆商均明显升高（P<0.01）;试食后试食组与对照组比较，除指向记忆无明显变化外，其他各项得分均明显升高，总量表分和记忆商也显著提高（P<0.01）。统计结果表明，受试物对语文和非语文的记忆能力，即大脑左半球和右半球的记忆功能均有所改善。

Suzuki S等[11]喂食60mg/kg·d经转磷脂酰作用合成的大豆磷脂酰丝氨酸（SB-tPS）60d后，对记忆损伤年长大鼠进行Morris实验，大鼠的行为得到了显著提高，实验还发现，SB-tPS产品能促进乙酰胆碱的释放和Na+/K+-ATP酶的活性，乙酰胆碱在大脑中不断积累，脑神经细胞间的信息传递速度加快，从而起到了促进大脑功能、增强记忆和思维等能力。Jorissen BL等[12]以120名老年ARCD（与年龄相关的认知能力降低）和AAMI（与年龄相关的记忆损伤）患者为研究对象每天服用剂量为200mg的PS产品进行营养补充，结果显示，经过PS产品治疗6～12周后，患者各项生化、血液指标及心率等与标准安全指标无显著差异，该研究证明，PS不仅可改善由年龄引发的认知能力降低和记忆损伤，而且无副作用产生。本实验人体部分按照160mg PS的每日摄入量，实验结果阳性，安全性等综合评估与上述评估结果一致，说明该复合配方中PS的设计剂量合理。配方另一有效成分DHA同样也具有改善记忆的功能，徐维盛等[13]在DHA藻油软胶囊改善小鼠记忆功能的研究结果表明，折合后推荐的DHA人体使用量在200mg/60kg·d较低量时具有改善记忆的功能，本实验中，人体实验复合配方折合80mg/60kg·d的低使用量同样达到了改善学习记忆的功效，而且人体实验效果较为明显。一些研究者通过体外培养发现，单纯DHA的增加对神经2A细胞不能起到保护作用，而当DHA与PS结合后才能对2A细胞发挥保护功能[6];同样，Kim等[14-16]的研究也发现，当细胞富含DHA但缺乏PS时，细胞的程序性死亡仍不能被有效阻止。然而，如果将DHA与PS共同来完成改善大脑功能，效果会更加完善，DHA不但可以促进大脑对PS的吸收，同时单纯服用DHA，不仅会增加胃肠的负担，而且也容易氧化，导致吸收效率下降，而且不容易通过血脑屏障[17]。有关数据[18]表明，当DHA连接到溶血磷脂甘油骨架的2位时，其吸收效率是非酯化DHA的10倍。通过以上结果表明，当DHA与PS两种成分同时作用时，两種剂量虽然摄入量均不高，但达到的改善学习记忆的效果则十分明显。

研究证实，Zn2+在神经变性疾病阿尔茨海默病（AD）的发病机制中起着重要作用，是 AD 病变时淀粉样斑块和淀粉样脑血管病的重要组成部分。在小鼠模型和 AD 病人的研究中发现，AD存在时Zn2+稳态是失衡的。研究发现，锌稳态失衡（锌缺乏）能够引起神经元严重损害，导致包括 AD 等在内的多种神经变性疾病的发生[19]。根据最新的中国居民膳食推荐摄入量可知，成年人的锌推荐摄入量为男12.5mg/d、女7.5 mg/d，通过每日添加11.2mg锌到人体后，可明显地改善人体的记忆能力。Chang 等[20]研究证实，牛磺酸能够通过清除线粒体中活性氧含量和 p53 相关的细胞凋亡通路抑制氧化低密度脂蛋白诱导的己糖激酶 2细胞的毒性，其中 p53 信号通路也是氧化应激作用的经典通路[21]。李乐慧等[22]在对牛磺酸的氧化损伤的保护作用研究中阐明，牛磺酸能够显著降低甲基汞导致的大鼠脑活性氧生成量，显著增加 SOD、GSH-Px 的活性，巯基、羰基和 MDA 的含量显著降低。郑加嘉等[23]对牛磺酸的抗氧化能力进行测定的结果表明，牛磺酸对超氧阴离子自由基和羟自由基具有较强的清除作用，且在一定范围内存在量效关系。然而，抗氧化及清除自由基损伤能够影响脑内部一系列抗氧化酶系，从而对损伤组织脑神经元起到修复、改善作用，所以，每日牛磺酸240mg的含量，对于改善学习记忆起到了不可或缺的作用。

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Abstract：Objective  To observe the effect of phosphatidylserine composite capsule on improving learning and memory function in mice and humans.Method  In the animal test section，Kunming female mice were randomly divided into low，medium and high dose groups（dose of 333，667 and 1 000 mg/kg·BW，respectively）and a negative control group.There were 12 mice in each group，48 mice in each group were given a behavioral test.After 30 days of continuous gavage，the water maze test，the platform test and the dark test were performed.A week later，another mice were used to repeat the same test in the same number and method.In the human test section，healthy retirees with informed consent of 49～65 years old were randomly divided into the test group and the control group，57 in the test group and 59 in the control group，taking 30 days，and the control group was given a placebo.At the beginning and end of the experiment，the clinical memory scale measurement and evaluation prepared by the Institute of Clinical Psychology of the Chinese Academy of Sciences was used to compare and compare the scores of the subtests with the memory quotient.Result  The phospholipid serine compound capsule could prolong the test latency of the mouse platform test and reduce the number of mistakes in the platform training.The latency of the mouse darkening regression test was prolonged，and the difference was significant（P<0.05）.Repeated tests were also positive.After taking phosphatidylserine compound capsules，the scores and memory quotient of each score scale in the trial group were significantly higher than those before the experiment（P<0.05）.Compared with the control group，the scores of each score scale（except directional memory）and memory quotient in the trial group were improved，with statistical significance（P<0.05）.The total score and memory quotient test group had significant difference before and after the trial，and significantly increased after the trial（P<0.05）.Conclusion Phosphatidylserine compound capsule has the effect of improving the learning and memory function of mice and human body.

Keywords：phosphatidylserine（PS）;behavior experiment;learning and memory;clinical memory scale

（责任编辑 李婷婷）