自体富血小板凝胶的制备及其生长因子分析

王鑫 董春英 赵玉慧 王丽娜

【摘要】目的：分析不同離心法制备自体富血小板凝胶的方法，通过改变离心速度，分析不同离心力对PLT浓度的影响;以及全血和APG中5种生长因子的浓度。方法：对20例难治性糖尿病皮肤溃疡患者应用APG治疗，以3种离心速度制备PRP。采用全自动血细胞分析仪测定各组全血及PRP中PLT数量，酶联免疫吸附法测定全血及APG中PDGF-BB、VEGF、IGF-1、EGF、TGF-生长因子浓度。结果：B组PRP中PLT计数最高（P<0.05），PLT回收率也较高。APG中PDGF-BB、EGF、IGF-1和TGF-（P<0.05）的浓度均高于全血中的浓度，差异有统计学意义（P<0.05）。20例患者经APG治疗后，16例窦道治愈率为88.9%。结论：制备PRP的最佳方法是先离心313×g 4min，再离心1252×g 6min，APG中生长因子浓度高于全血，PL值与PDGF-BB和TGF-浓度成正相关。

【关键词】自体富血小板凝胶;制备;生长因子

【中图分类号】R94                        【文献标识码】B                          【文章编号】2096-7225（2020）03-0001-01

1资料与方法

1.1一般资料

本次纳入20例患者，其中背部深部溃疡4例，骶尾部褥疮3例，髋部褥疮3例，小腿溃疡2例，足部溃疡8例。合并窦道18例，骨髓炎及死骨形成2例。若一次治疗效果不满意，两周后再行APG治疗。

1.2主要试剂与仪器

凝血酶;10%葡萄糖酸钙;鼠抗人TGF-、VEGF、PDGF-BB、EGF、IGF-1等ELISA试剂盒。电子天平;真空采血管;XE2100全自动血细胞分析仪;注射器;低速离心机;-80℃冰箱;低温离心机;MK3酶标测试仪。

1.3不同的离心方法制备PRP

根据离心方法的不同，将患者分为A、B、C三组。根据溃疡面积与窦体积抽取外周静脉血。取全血3mL，其中2mL用于全自动血细胞分析仪进行血细胞计数，1mL保存于-80℃冰箱中进行生长因子测定。其余全血用三种方法离心。A组：全血529×g离心4min，将界面附近约1mm的上血浆和RBC转移到另一离心管中;再以854×g离心6min后，可见底部薄层红RBC上沉积有白色膜状物质，即PLT沉积层;上部为含有极少量未沉淀PLT的血浆层。上部大部分血浆是用巴氏管吸取，其余所需血浆和血细胞成分静置30min后振摇离心管，使RBC及PLT重悬在剩余血浆中，即得PRP，制备6次。B组：制备方法与A组相同，改变离心速度与时间，先用313×g离心4min，再用1252×g离心6min，共5次。C组：制备方法与A组相同，改变离心速度及时间，先用176×g离心5min，再用1252×g离心5min，共5次。每种方法取PRP 2mL进行血细胞计数，余制备APG。

1.4APG的制备与应用

将PRP与凝血酶和钙剂按10：1的比例混合得到APG，取本品1mL于-80℃冰箱中保存，测定生长因子浓度。在标准治疗的基础上，将剩余的APG用双通注射器均匀喷洒在溃疡表面或深窦道内，表面覆盖凡士林油纱48～72h;15d后溃疡肉芽组织生长不良，进行第二次APG治疗。

1.5测定血细胞及APG中生长因子的浓度

将保存在-80℃冰箱中的APG及全血样品在室温下解冻，酶联免疫吸附法测定全血及APG中PDGF-BB、VEGF、IGF-1、EGF、TGF-的生长因子浓度。

2结果

2.1PLT计数与生长因子浓度的相关性分析。Pearson相关分析显示，PLT数与PDGF-BB、TGF-浓度呈正相关，但与其它三种生长因子浓度无相关性。

2.2临床治疗结果。20例患者溃疡面积明显小于治疗前（P<0.05）。18例合并窦道患者中，16例经APG治疗后痊愈，治愈率为88.9%。其中，8例经1次APG治疗后3d完全封闭;第一次治疗后6例窦道体积明显缩小，第二次治疗后3d窦道完全封闭;第三次治疗后1例窦道封闭愈合;2例骨髓炎伴有死骨形成的患者，在死骨未清除前行APG治疗二次后窦道无变化，后经外科切除坏死骨质后痊愈;1例左髋部窦道在二次APG治疗后窦道体积无明显变化。

3讨论

当前，PRP的制备方法主要有血浆分离置换法及离心分离法。其中，血浆分离置换法是利用多功能医用血成分自动分离设备单独采集PLT制备浓缩PLT成分。该方法自动化程度高，PLT纯度及浓度高，但设备较昂贵，限制了其在临床上的广泛应用。为了寻找合适的离心速度，提高PLT的富集率，研究了三种离心方法对PLT富集效果的比较。然而，不同方法制备的PRP中PLT数量有很大差异。

APG治疗的主要机制是PLT被激活后釋放多种高浓度生长因子，比较全血与APG中TGF-、VEGF、PDGF-BB、EGF、IGF-1等生长因子的浓度，结果发现APG中PDGF-BB、EGF、IGF-1、TGF-的浓度明显高于全血（P<0.05），VEGF的浓度也有升高;相关分析表明，PLT计数与PDGF-BB、TGF-的浓度成正相关。APG中TGF-、VEGF、PDGF-BB和EGF的浓度显著升高，而IGF-1的浓度与全血相比无显著性差异，TGF-浓度与PLT数量成正相关;另外，APG和PLT缺陷凝胶中PDGF-AB、EGF、TGF-、VEGF、肝细胞生长因子（HGF）、TGF-1，发现在PRP中PDGF-AB及TGF-浓度显著升高，并与PLT数量成正相关;但VEGF、EGF、HGF和IGF-1均未升高。本研究比较了细胞培养6d前后培养液中生长因子的浓度。结果发现，培养后TGF-、VEGF、HGF浓度明显升高，IGF-1浓度无明显变化，PDGF-AB、EGF浓度降低。以上结果表明，大多数生长因子的浓度随着离心后PLT浓度的增加而升高。然而，PLT激活和释放生长因子是一个复杂的过程，APG中大量生长因子未完全释放，PLT的增加并不能立即升高所有生长因子的浓度，PLT中生长因子的释放顺序及调控机制有待进一步研究。

参考文献：

[1]袁南兵.自体富血小板凝胶在难治性糖尿病皮肤溃疡中的应用[J].中国修复重建外科杂志，2015（09）.

[2]宋扬.传统二次离心法和改良法制备富血小板血浆的比较研究[J].实用口腔医学杂志，2015（05）.

[3]张翔迅.自体富血小板凝胶的制备及其生长因子分析[J].中国修复重建外科杂志，2016（04）.

项目名称：黑龙江卫生计生委科研（项目编号：2017-491）