基于水分活度测定的发酵胡萝卜浓缩汁细菌检测方法

杨晓莉 李翠 谢毓华 绳金房

摘要：目的：从水分活度测定以及影響水分活度的关键限值（温度和pH）出发，研究发酵胡萝卜浓缩汁细菌生长情况。方法：选取山东绿维胡萝卜浓缩汁，由该发酵胡萝卜浓缩汁剥离提纯的萄球菌、铜绿假单细胞菌、大肠埃希氏菌、腐生酵母菌，用1mol/L的盐酸和氢氧化钠对胡萝卜浓缩汁的酸碱度进行调整，以80%的甘油溶液调整水分活度，测定细菌最大生长率、生长迟滞时间、细菌生长条件理论最低值以及细菌生存概率。结果：水分活度，以及影响水分活度的温度和pH两个关键限值，都是细菌滋生的必要条件，当温度设置在37℃时，随着水分活度的不断增加，以及影响水分活度的关键限值pH值增加，发酵胡萝卜浓缩汁的葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单细胞菌的逐渐增加，生长速率呈上升趋势，3种细菌的最低水分活度是097，水分活度的最低温度以及最低pH值分别是453℃和393;影响发酵胡萝卜浓缩汁风味的腐生酵母菌随着水分活度的不断升高，最大生长率不断提升，迟滞时间逐渐缩短。结论：水分活度，以及影响水分活度的关键限值温度和pH值在细菌滋生的时候相互作用，水分活度越高，影响水分活度的关键限值温度和pH越高，发酵胡萝卜浓缩汁细菌的生长速率越快，存活率越好。

关键词：水分活度;细菌;检测;生长速率;迟滞时间;生存概率

由乳酸菌制成的发酵胡萝卜浓缩汁营养含量高，能够更好地调节人体免疫功能[13]。发酵胡萝卜浓缩汁在出厂前都会在不破坏液体原有菌落的基础上进行非热杀菌处理，但是此种杀菌技术效果并不好，在其他环节如果控制不当，很容易滋生细菌。水分活度已经被发达国家广泛应用于食品范畴内，长期研究表明，水分活度数值与细菌繁殖数量有对应关系，是延长货架期反映食品腐败性的关键参数[45]。研究人员通过研究水分活度的关键限值对应的各微生物生长发育情况[68]，得到细菌繁殖的速度受到水分活度影响。因此，本研究从水分活度以及影响水分活度的关键限值（温度和pH）出发，对发酵胡萝卜浓缩汁细菌检测进行研究。

1材料与方法

11实验菌株

选取山东绿维胡萝卜浓缩汁，市场售卖直投式发酵剂，乳酸菌菌种。用1mol/L的盐酸和氢氧化钠对胡萝卜浓缩汁的酸碱度进行调整，以80%的甘油溶液调整水分活度。将由发酵胡萝卜浓缩汁剥离提纯并经过VITEK2 Compact鉴定的葡萄球菌、铜绿假单细胞菌、大肠埃希氏菌、腐生酵母菌，培养于蛋白胨肉汤斜面培养基，贮藏于冰箱内设置温度为4℃，为保持活力，每月传代1次。

12仪器及试剂

莱希特水分测试仪，深圳市莱希特科技有限公司;TS130酸度计，郑州凯达环保科技有限公司;UV1902PC分光光度仪，上哈奥析科学仪器有限公司;甘油，山东鲁里亚新材料公司。

13方法

131细菌生存概率测定在盛有水分活度和pH已经调整过的9mL发酵胡萝卜浓缩汁的试管中滴入1mL经过发酵胡萝卜浓缩汁稀释过的细菌培养液，此时菌液浓度为502*103CFU/mL，设定不同温度培养48h，进行吸光度值测定，假如发酵胡萝卜浓缩汁经增菌液培养前后的吸光度值差值小于0002（±0002是分光光度计下的相对误差范围），那么这些细菌就能生存，如果没有明显差别，那么这些细菌就不能生存（以2值变量0表示）。

132细菌生长条件理论最低值和生长迟滞时间确定模型处于对数生长期时，微生物的整体发育如同化学反应时的一级催化反应，具体为某时间点的细胞数量（或质量）与细胞数量（或菌体质量）的增长速率的比是常数。当对数生长为t0时，测出的细胞数目是N0;当对数生长为t时，测出的细胞数目是Nt，通过式（1）可得出培养基内的细菌生长速率常数为μ。

μ=（1gNt-1gN0）tt0*2 303（1）

设定生长温度最低值为Tmin，在pH 65、水分活度为099时，培养基中的5种不同细菌在不同温度条件下的生长速率，采用SPSS V260软件统计数据，Ratkowsky模型参数在使用迭代计算时会运用LevenbrrgMarquardt过程，从而得出式（2）：

μmax=b（TTmin）{1exp[cTTmax）]}（2）

式（2）中，细菌最高生长速度为μmax，细菌理论最高生长温度为Tmax，最低生长温度为Tmin，，模型参数分别为b和c。最低水分活度和pH值分别为Awmin和pHmin，细菌最大生长率，修正公式如式（3）：

μmax=a（AwAwmin）*（pHpHmin）*（TTmin）2（3）

导入SPSS V260软件，Ratkowsky模型参数在使用迭代计算时会运用LevenbrrgMarquardt过程迭代计算[9]，得出pH理论最低值和限制微生物生长的水分活度分别为Tmin和pHmin。

生长迟滞时间为式（4），其中模型系数分别为a和d。

λ=d*（AwAwmin）*（pHpHmin）*（TTmin）2 （4）

式（4）中，Awmin是限制细菌生长的水分活度，pHmin是pH的理论最低值，Tmin是温度理论最低值。应用响应面模型，最大生长速率为式（5），生长迟滞期为式（6）。

μm=Iμ+m1T+m2pH+m3Aw+m4T2+m5pH2+m6A2w+m7TpH+m8TAw+m9pHAw （5）

λm=Iλ+l1T+l2pH+l3Aw+l4T2+l5pH2+l6A2w+l7TpH+l8TAw+l9pHAw

（6）

式（5）～（6）中，模型常数分别为Iμ和Iλ，模型系数分别为m19和l19。

2结果与分析

21葡萄球菌、铜绿假单细胞菌、大肠埃希氏菌生存概率

观察发酵胡萝卜浓缩汁的葡萄球菌、铜绿假单细胞菌、大肠埃希氏菌生存概率、水分活度对细菌繁殖的影响。实验设计采用三因素五水平CCD方案，参照水分活度范围、发酵胡萝卜浓缩汁的储藏温度以及限制细菌生长条件最低值等因素。当水分活度较低，同时影响水分活度的温度和pH两个关键限值都较低的情况下，3种发酵胡萝卜浓缩汁细菌的生存概率也较低，从表1可看出，当水分活度为096，同时影响水分活度的温度仅为10℃、pH为46时，葡萄球菌、大肠埃希氏菌及铜绿假单细胞菌生存概率几乎为0;当水分活度为0963，影响水分活度的温度为26℃、pH为46时，细菌生存概率为100%。由此可见，水分活度，以及影响水分活度性能的两个关键限值温度以及pH相互作用相互影响，是细菌滋生的必要条件（表1）。

22不同水分活度下细菌生长速率

从表2可以看出，当温度设置在37℃，在不同水分活度以及不同影响水分活度的pH情况下，发酵胡萝卜浓缩汁3种细菌的生长速率受到不同影响。随着pH值与水分活度的不断增加，3种细菌的生长速率逐渐升高。将通过表2得出的生长速率数值与已知的最低生长温度理论值Tmin带入式（3），得到发酵胡萝卜浓缩汁3种细菌存活的最低水分活度、最适宜温度和最低pH。从表3可以看出，发酵胡萝卜浓缩汁3种细菌的存活最低水分活度都为093左右;葡萄球菌及大肠埃希氏菌的最低存活温度分别为831、761℃，而铜绿假单细胞菌无论是最低温度还是最低pH值都低于另两种细菌，说明要确保3种细菌的出现，最大水分活度要保证为097，同时要确保影响细菌水分活度的温度最低为453℃、pH最低为393。在试验中，铜绿假单细胞菌的最低水分活度较高，而大肠埃希氏菌和葡萄球菌的最低水分活度较低，原因是此实验以甘油作为水分活度调节剂，甘油更易渗入细胞内部，降低细胞内水分活度更快，对细胞器及大分子物质起到保护作用。

23腐生酵母菌最大生长速率和迟滞时间

发酵胡萝卜浓缩汁中的腐生酵母菌是影响发酵胡萝卜浓缩汁风味的主要微生物之一。如果水分活度，以及影响水分活度的温度和pH等条件合理，腐生酵母菌就会批量繁殖，产生代谢副产物。腐生酵母菌是一种腐败菌极易使发酵胡萝卜浓缩汁腐化变质腐，测试其在24℃情况下，不同水分活度以及不同影响水分活度的pH情况下的生长速率。分析表4可得，在24℃时，不同水分活度以及不同影响水分活度的pH条件下，测得的发酵胡萝卜浓缩汁的腐生酵母菌最大生长速率和迟滞时间有所不同，随着水分活度和pH的不断升高，腐生酵母菌的最大生长率不断提升，而迟滞时间逐渐缩短。

3讨论

水分活度一般指自由水，每种微生物滋生所需的最低水分活度不同[1012]。

本研究显示，当水分活度逐渐提高，且影响水分活度性能的温度和pH逐渐提高，则发酵胡萝卜浓缩汁的葡萄球菌、铜绿假单细胞菌、大肠埃希氏菌、腐生酵母菌细菌生长情况越好。在水分活度为099时，细菌生长速率最快。其中，葡萄球菌的最低生存值为温度831℃、

pH 421、水分活度0937;铜绿假单细胞菌的最低生存值为温度453℃、pH 421、水分活度094;大肠埃希氏菌最低生存值为温度761℃、pH 414、水分活度0937。由此可知，如果发酵胡萝卜浓缩汁的水分活度低于093、pH低于39、所处环境温度低于4℃，以上3种细菌将很难成活。且本研究发现，要确保3种细菌的出现，最大水分活度要保证为097，同时要确保影响细菌水分活度的温度最低为453℃、pH最低为393。

水分活度和pH越大，发酵胡萝卜浓缩汁腐生酵母菌的最大生长率越快，迟滞时间越短。临界条件下，发酵胡萝卜浓缩汁中的大肠埃希氏菌、葡萄球菌和铜绿假单细胞菌在不同水分活度、温度和pH间具有相互作用，从本研究数据中可以看出，水分活度与pH、温度在细菌的生存极限影响中相互作用[1314]，假如细菌的生存温度逐渐降低，在水分活度和pH条件较高的情况下，细菌的生长受到抑制，由此可见，发酵胡萝卜浓缩汁要尽量贮存于低温环境[15];如果将水分活度和pH条件降低，那么温度可以相对升高，发酵胡萝卜浓缩汁就可以常温保存了，这样不但节约了贮存和运输成本，也降低了能源消耗。

4结论

本研究从水分活度测定出发，构建发酵胡萝卜浓缩汁细菌生长速率和生长概率模型，通过水分活度以及影响水分活度的两个关键限值温度和pH，检测发酵胡萝卜浓缩汁内细菌生长情况，研究发酵胡萝卜浓缩汁的葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单细胞菌的生成概率和生长速率，以及腐生酵母菌的最大生長概率以及迟滞时间，发现发酵胡萝卜浓缩汁各种细菌的生存概率，同水分活度以及影响水分活度的两个关键限值温度和pH影响，温度和水分活度越高，细菌生存概率越高。◇

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