碘过量对NOD·H2h4小鼠甲状腺转录组影响的分析

曹晓晓 徐菁 王海燕 马巍 李秀维 王建强

摘要：目的：对比分析碘营养适宜和过量对有自身免疫性甲状腺炎遗传倾向小鼠甲状腺转录组的影响，为碘过量致自身免疫性甲状腺疾病的发病机制提供科学依据。方法：将18只5周龄NOD·H2h4小鼠随机分为对照组和高碘组，分别予适宜碘和过量碘饲养16周。ELISA和HE法进行血清甲功和甲状腺病理检测。建立甲状腺转录组文库，利用Illumina HiSeq平台测序，进行基因转录组表达差异和差异基因KEGG通路分析。结果：适宜碘和过量碘饲养建立了甲状腺正常和自身免疫性甲状腺炎小鼠模型，两组小鼠甲状腺转录组存在304个差异表达基因，其中与细胞因子、细胞趋化因子和细胞粘附分子通路，以及抗原处理呈递相关的基因转录水平在高碘组显著升高。结论：碘过量可能会过度激活多个与免疫反应和炎症发生密切相关的分子通路，共同促进自身免疫性甲状腺疾病的发生发展。

关键词：碘过量;转录组学;自身免疫性甲状腺疾病;小鼠

国内外流行病学调查显示，碘缺乏地区人群在补碘后较长时间内AITD患病率和发病率均会增高[12]，且高水碘地区的居民中甲状腺自身抗体阳性伴随甲状腺功能减退的患者显著多于适碘地区[3]，这些现象能够在有疾病遗传易感性的动物模型中得到重复。研究发现，90%的NOD·H2h4小鼠在005%NaI水喂养的条件下可被诱发出实验性自身免疫性甲状腺炎（EAT）[4]。可见，碘过量是AITD发病的危险因素，特别是对于具有遗传背景的敏感人群而言，过量碘摄入可能会诱导或加速该类疾病的发生发展。有学者认为，碘过量可导致甲状腺上皮细胞氧化应激增强，造成细胞损伤，进而诱导甲状腺滤泡上皮细胞发生凋亡，诱发甲状腺免疫功能异常[56]。另外，过量碘摄入还可促使甲状腺球蛋白（Tg）碘化程度增高，进而可能增加其免疫原性[1]。然而，有关碘摄入过量诱发AITD的具体分子机理目前尚不明确。近年来，随着高通量分析技术和信息科学的迅速发展，转录组学能够在整体水平上研究细胞特定时空中全部基因转录本种类、结构和功能及转录调控的学科，其相关技术为疾病的不同阶段、不同结局的分子机理和调控网络的研究提供了强有力工具[7]。本研究通过适宜碘和过量碘饲养具有自身免疫性甲状腺炎遗传倾向的NOD·H2h4小鼠，建立甲状腺正常和EAT小鼠模型，对比分析两组甲状腺转录组学，旨在探索碘过量摄入诱发自身免疫性甲状腺炎中发挥关键作用的相关通路，为碘致AITD发病的分子机制提供科学依据。

1材料与方法

11仪器与试剂

NaI，上海国药集团化学试剂有限公司;ELISA试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;RNA提取与纯化试剂盒、cDNA文库构建试剂盒、PCR反应体系，深圳华大基因有限公司;其余试剂，均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

AR3130电子天平，中国上海梅特勒托利多公司;5407离心机，德国Eppendorf公司;EXL 800酶标测试仪，美国Biotech公司;AE31显微镜，中国厦门麦克奥迪公司;Hiseq 2500测序平台，Illumina公司。

12实验动物与分组处理

5周龄雌性NOD·H2H4小鼠（中国医科大学滕卫平教授课题组惠赠），在中国疾病预防控制中心实验动物中心SPF环境下饲养。按体重将18只小鼠随机分成2组：对照组（C）和高碘组（HI），每组9只，分别给予蒸馏水和005%NaI水[4]喂养16周。第16周末处死小鼠，取血清和甲状腺，将甲状腺的一叶固定在4%多聚甲醛溶液中，另一叶在液氮中快速冷冻。本实验程序经中国疾病预防控制中心动物伦理委员会审核批准（批准文号：NHPF064101）。

13血清指标的ELISA检测

每组随机取5只小鼠血清，进行甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、促甲状腺素（TSH）的检测，采用ELISA检测试剂盒，具体操作参照说明书。

14甲状腺组织病理检测

与13相对应，取5只小鼠的一叶甲状腺进行病理检测。采用HE染色，在光学显微镜下观察。甲状腺炎症程度分级主要依据甲状腺滤泡破坏程度和淋巴细胞浸润。“-”代表阴性;“+”代表有淋巴細胞浸润，滤泡腔内充满胶质，滤泡上皮细胞变扁平;“++”代表有淋巴细胞浸润，出现较多的大滤泡腔，部分有融合破坏;“+++”代表有淋巴细胞浸润，50%的滤泡腔壁断裂、破坏;“++++”代表所有的滤泡腔遭到破坏或者没有滤泡腔存在。

15转录组建库与测序

每组随机取9只小鼠的一叶甲状腺组织，分别称量，各加入500μL Trizol 裂解液，放入研磨机中，研磨30s，取出静置5min，使组织细胞充分裂解。4℃、12 000 g离心5min。将上清转入加有100μL氯仿/异戊醇（24∶1）的EP管中，颠倒振荡混匀。4℃、12 000 g离心8min。将上清转入加有200μL异丙醇的离心管中，颠倒混匀置于-20℃冰箱静置2h以上。4℃、17 500 g离心25min，弃上清，用09 mL 75%乙醇洗涤，上下颠倒悬浮沉淀，4℃、17 500 g 离心3min。弃上清，短暂离心后吸去残留液体，晾干3～5min。用50μL DEPC水溶解沉淀。Aglient 2100 Bioanalyzer进行RNA定量。将每组9叶甲状腺RNA随机分成3个亚组（对照组分为C1、C2、C3;高碘组分为HI1、HI2、HI3），每个亚组取3只小鼠等量的RNA进行混匀。然后分别取等量 1μg 亚组RNA样品，使用oligodT磁珠进行纯化。将纯化的mRNA依次进行片段化处理，cDNA合成，末端修复和接头连接，PCR反应及产物回收，建立最终文库样本。按照Illumina Hiseq 2500测序平台的操作说明制备上机样本，进行测序;测序结束后，整理数据，并进行生物信息学统计和分析。

16测序结果的分析

共得到6个样品原始测序结果，平均产出为550 Gb/样品。然后过滤去除测序的原始数据（raw reads）包含低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的序列。使用HISAT[8]将过滤后的序列（clean reads）与参考基因组序列进行比对，分析样品之间的可比性。然后对组间基因表达差异性分析和差异基因的京都基因和基因组数据库（KEGG）的通路注释分析。

17统计分析

利用SPSS l30软件进行统计分析。正态计量资料用±s表示，两两比较采用t检验;非正态计量资料用中位数M（p25～p75）表示，组间比较选用秩和检验，相关性分析采用Spearman线性相关;计数资料的比较采用χ2检验，检验水准α=005。

2结果与分析

21小鼠模型的验证

由表1可见，与C组相比，HI组小鼠血清中TPOAb和TSH水平显著升高，而血清FT3水平降低，差异均有统计学意义（P<005）。HI组小鼠表现出自身免疫性甲状腺炎的血清学特征。由图1可见，C组甲状腺组织形态和结构正常，而HI组小鼠甲状腺组织则出现了滤泡扩张和融合，滤泡内胶体积聚，甲状腺滤泡上皮细胞扁平以及少量淋巴细胞浸润。结合血清学结果，本研究通过适宜碘和过量碘饲养NOD·H2h4小鼠分别建立了甲状腺正常小鼠和EAT小鼠模型。

22小鼠甲状腺组织转录组差异表达分析

针对每个样本的原始测序数据进行质量评估，经过测序数量质量剪切及统计，与小鼠参考基因组对比，进行转录组整体质量评估。

221测序结果质量分析测序的原始数据包含低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的序列。数据分析之前需要去除这些序列以保证结果的可靠性。得到clean reads之后，使用 HISAT[8]将其与参考基因组序列进行比对。平均每个样品的比对率达到 8699%，同时样品间均匀的比对率表明样品之间的数据具有可比性（表2）。

222组间差异表达基因分析图2结果显示，C组和HI组高碘组的基因转录表达存在一定差异性，其中304个基因表达有显著统计学差异。如图2A所示，使用散点图展示差异表达基因（DEG）的分布。与C组相比，HI组有168个基因的表达水平降低、125个基因的表达水平升高。并且对每组 DEG 作表达量热图（图2B）。

223差异表达基因的KEGG分析将差异表达基因进行KEGG通路注释分析。根据P值和Q值从大到小进行排列（表3）。其中与机体免疫反应和炎症发生密切相关的TNF信号转导通路，细胞粘附分子（CAMs）、细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路，以及抗原处理及呈递均在高碘诱发的EAT小鼠甲状腺组织中过度激活。

细胞因子主要包括肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）等[9]。研究发现，AITD患者血清中TNF水平显著升高[10]，且高碘刺激还可诱导AITD患者甲状腺组织分离细胞中TNFα的高表达[11]。同样，本研究中TNF通路在EAT小鼠甲状腺中也异常活跃，其中TNFα诱导蛋白3（Tnfaip3）、TNF 受体超家族1b（Tnfrsf1b）、IL1、IL18等基因呈高表达状态。除了细胞因子通路，在机体免疫应答过程中，细胞趋化因子则参与淋巴组织的发生与分化过程。现已证实，甲状腺内淋巴细胞和甲状腺滤泡细胞均能产生CC和CXC细胞趋化因子，它们促进了炎症发展过程[12]。本研究发现，EAT小鼠甲状腺组织中CXC趋化因子配体10/11/16（Cxcl10/Cxcl11/Cxcl16）基因转录水平显著升高。其中，Cxcl10和Cxcl11分子水平被证实在AITD患者血清中显著升高[1315]。另外，CAMs通路能够介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互接触和结合，是免疫应答重要的分子基础。细胞间粘附分子1（Icam1）能促进甲状腺细胞与淋巴细胞的粘附与识别[16]。结果显示，Icam1转录水平在高碘诱发的EAT小鼠甲状腺中高于适碘对照组，且CAMs cd40在HI组也是高表達的。可见碘过量摄入会过度激活甲状腺内多条交错复杂的分子通路共同促进EAT的发生发展。

KEGG分析还发现，高碘摄入能够改变甲状腺组织相容性抗原处理呈递关键基因的转录水平，主要表现为EAT小鼠甲状腺H2组织相容性抗原中H2Q2、H2Q8、H2Q10、H2T10、H2K2基因的转录水平的增高。甲状腺组织相容性抗原发生变化，可能会引起相容性抗原处理呈递的紊乱，最终导致甲状腺受到自身免疫细胞的攻击。当然，NODH2h4小鼠的H2抗原相关基因表达水平的升高与其AITD遗传倾向性的特征可能有关，而过量碘摄入则诱发了这一改变。

3结论

通过适宜碘和过量碘饲养NOD·H2h4小鼠成功建立了甲状腺正常小鼠和EAT小鼠模型。经对比分析两组小鼠甲状腺组织的转录组学，揭示出碘摄入过量可能会过度激活细胞因子、细胞趋化因子、CAMs以及抗原处理呈递等相关的分子通路，共同诱发和促进了小鼠甲状腺炎的发生发展。然而，转录组的这种变化是否会随着碘干预时间、浓度和动物模型类型的不同带来结果上的差异仍有待于进一步的研究。

感谢中国医科大学滕卫平教授课题组惠赠NOD·H2h4小鼠。◇

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