番茄抗黄化曲叶病研究进展

马艺荞 范惠冬 郑士金 郑建超 耿伟

摘 要：番茄黄化曲叶病是番茄生产中毁灭性病害。本文系统的综述了番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）發生规律、番茄黄化曲叶病毒病（TYLCVD）抗病基因及防治措施三个方面内容。为番茄黄化曲叶病毒病的监控、防治提供科学依据。

关键词：番茄黄化曲叶病;抗病基因;防治措施

番茄黄化曲叶病（Tomato   yellow   leaf   curl   virus   disease，TYLCVD）的发生给全球番茄生产造成了巨大的经济损失[1]。2011年番茄黄化曲叶病毒（Tomato   yellow   leaf   curl   virus，TYLCV）被列入十大重要植物病毒之一[2]。1939-1940年，番茄黄化曲叶病在以色列被首次发现[3]，1995年该病传入我国[4]，近年来在我国多个番茄主产区大范围发生，2011年该病在我国新疆喀什地区番茄主产区大面积爆发，发病率最高达100%[5]。2014年有报道称该病在我国的年发生面积超过20万亩，年经济损失超过十亿元[6]。

近几年该病害的发生具有爆发突然、发病迅猛、扩散迅速、危害严重、治疗困难、损失巨大等特点[7]，因此，番茄黄化曲叶病的综合防控研究已经刻不容缓。目前针对该病的防治，可通过化学防治、生物防治和物理防治的方法在一定程度上减轻该病的危害，但都存在防治不彻底、易复发等问题，无法从根本上解决这一问题，而选育番茄抗黄化曲叶病品种是较为经济、有效、绿色、持久的防治方法[2，8]。

1 番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）

1.1. TYLCV基因组组成及结构

番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）属于双生病毒科（Genminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA（Singlestranded  DNA，ssDNA）。与其它大多数菜豆金色花叶病毒不同，TYLCV是植物病毒中唯一一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒[9，10]。TYLCV的寄主非常广泛，包括茄科、葫芦科、豆科、菊科、十字花科、白花菜科等12个科，主要侵染茄科。2009年，Michael等研究表明，很多野草也是TYLCV的寄主，但一般情况下是无症状感病。

TYLCV的DNA-A编码6个开放性阅读框（Opening   reading frames，ORFs），这些ORF被大约200bp的基因间隔区（Intergenic region，IR）分为病毒链和互补链，病毒链编码V1和V2，互补链编码C1，C2，C3和C4。2007年，Bruno Gronenborn等研究发现IR区最突出的区域是茎-环结构：由2个10-12bp的反向重复序列的茎和1个包含9个核苷酸序列[12，13]。

2 番茄黄化曲叶病（TYLCV）抗病基因

据报道，早期的栽培番茄种质资源中缺乏抗TYLCV的基因，仅有一些表现为耐病的资源，抗TYLCV的基因大多存在于番茄的近缘野生种中[14]。过去的研究表明，在秘鲁番茄（Lycopersicon  peruvianum）、醋栗番茄（Lycopersicon  pimpinellifolium）、契斯曼尼番茄（Lycopersicon  cheesmanii）、多毛番茄（Lycopersicon hirsutum）和智利番茄（Lycopersicon  chilense）这几种野生番茄中筛选出抗TYLCV的基因[15]。通过将栽培种与这些野生番茄进行杂交，可以将抗TYLCV的基因转入到栽培番茄中，从而使栽培番茄产生抗病性。

目前，已经定位到的抗TYLCV基因有6个，分别为Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-4，Ty-5和Ty-6，这6个基因在染色体上的位置各不相同，功能上又各具特点（图1，表2）。

抗TYLCV基因连锁标记的开发，不仅为抗病基因的克隆奠定基础，同时也可用于抗病新品种的选育过程，可极大的提高育种效率。将目前与抗TYLCV基因紧密连锁，且应用较多的分子标记汇总于表3，方便在后续育种工作中得以应用。

3 番茄黄化曲叶病毒病（TYLCVD）的防治措施

自20世纪90年代传入我国以来，番茄黄化曲叶病毒病蔓延极其迅速，目前已在我国各大番茄产区大面积发生，给我国番茄生产造成了极大的损失。由于双生病毒科成员分布广泛且寄主范围多样，作为TYLCVD的传毒途径，烟粉虱数量的极速增加，因此TYLCVD引起了全球的重点关注，TYLCVD的防控形势十分严峻。目前，番茄黄化曲叶病毒病（TYLCVD）的遵循“预防为止、综合防治”的防治措施，采取包括加强苗期管理、物理防治、化学防治和生物防治的传统防治，以及RNA干扰（RNAi）技术、基因编辑、分子标记辅助选择（MAS）等新一代防治措施。这些措施不只局限于防治TYLCD，也适用于防治其他病毒病。

3.1 常规防治措施

防治任何疾病的首要任务是确定病因，然后再制定防治策略。许多病毒可能产生的症状较为类似，且有时多病毒复合侵染，单纯的目测法有一定的局限性。目前，可通过酶联免疫吸附（ELISA）法、聚合酶链式反应（PCR）法、核酸杂交法、环介导等温扩增（LAMP）法、实时荧光定量PCR（Real-time   PCR）等方法快速、准确的大量检测样本，对TYLCVD综合防治具有重要意义。

在种植前进行合理的规划是防治病毒病必不可少的环节。清洁棚内及园区卫生，及时清理棚内残株及周围杂草;可选择烟粉虱不喜食的作物进行轮作套作;抗病品种的种子需要通过正规渠道进行购买;在无病虫育苗基地进行育苗，加强苗期光、温、水、气、肥五个因素合理调控，提高番茄苗的抗病能力;定植期严防病株混入。

防控病毒病的关键有时不是病毒本身，而是病毒载体。因此，严控烟粉虱虫口数量对预防病毒病爆發十分有效。很多物理防治方式都在生产中已有广泛应用，如在大棚的通风口铺设50～60目的防虫网;利用烟粉虱的趋黄性，每亩地悬挂20～30张黄色粘虫板;利用烟粉虱的趋光性，在大棚悬挂10～15个/亩的荧光杀虫灯;利用不同颜色的地膜，对烟粉虱在叶片下的活动有较大影响等[19]。

化学防治仍是控制烟粉虱虫口数量的最直接有效的方式。阿维菌素、吡虫啉、啶虫脒、阿克泰和噻虫嗪等杀虫剂对防治烟粉虱效果较好。生产上选用的杀虫剂种类较多，且烟粉虱会在较短时间内产生抗药性，因此在今后的生产中应选用高效、低毒、低残留的化学药剂显得尤为重要[6]。

利用生物防治的方式，可以防控烟粉虱的种群数量爆发。例如烟粉虱的捕食性天敌，如瓢虫类、扑食蝽及捕食螨等;烟粉虱的寄生性天敌如恩蚜小蜂属的丽蚜小蜂、桨角蚜小蜂属的桨角蚜小蜂及阔柄跳小蜂属等。但由于捕食性天敌多为多食性捕食者，寄生性天敌需在烟粉虱虫口数量较低时发挥作用，且成本较高等因素，因此在实际生产中相对推广较难[20]。

总之，早期进行病毒检测，结合合理的综合防控管理方式，对防控TYLCVD是十分重要的。

3.2 新一代防治措施

转基因技术是控制病毒感染的有效途径，但是由于转基因生物（GMOs）的商业化受限，还未被民众接受。病原衍生抗性（PDR）策略在抗番茄黄化曲叶病研究上获得成功。2004年，Antignus.Y和YangY等已用病毒基因片段、TYLCV的CP和Rep基因进行植株转化，用于实现PDR。RNAi技术，包括发夹结构的病毒基因组序列的表达，已经获得很好的结果。2006年，Fuentes  A等将TYLCV的Rep基因转入番茄后，获得的植株对TYLCV的免疫能力。2007年，Zrachya  A等证实以TYLCV的CP为靶点的siRNA可使转基因番茄植株产生TYLCV抗性。2010年，唐前君等将TYLCCNV的CP基因构建dsRNA载体转入烟草中，获得TYLCV的抗性。2015年，Ammara，U.E.等研究表明，转化植株表达来自TYLCV-OM的IR、V1和V2区的dsRNA序列，可使约75%的转基因番茄感染减少。同年，Leibman，D.等也证实了免疫性与含有特异性病毒片段的转基因siRNAs产物有关。非转化方式的成本与可行性收到广泛关注。2019年，Leibman，D.和Cagliari，D.等为了避免公众对转基因生物的关注，采用一种在植物上喷洒dsRNA/siRNA的喷雾诱导基因沉默（SIGS）的非转化方式。合成miRNA介导的病毒基因沉默技术为抗TYLCV提供一种新途径。

2019年，Carbonell，A.等研究表明在抗番茄斑点萎蔫病毒（TSWV）上，合成反式作用siRNAs（syn-ta-siRNAs）比amiRNA在抗病性方面更有前景。

基因编辑技术是指对特定的DNA位点进行精准“编辑”的一项新技术，通过基因编辑可使靶向位点碱基的插入、缺失、替代等。目前最常见的基因编辑技术包括：锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）及CRISPR-Cas9系统。

目前，这些基因编辑技术已成功在番茄、马铃薯、葡萄、柑橘、甜瓜等多种果蔬作物中实现了基因组的定向编辑。近年来，CRISPR-Cas9系统应用在改进番茄重要农艺性状及研究番茄基因功能及其分子机制等方面。CRISPR-Cas9系统在番茄抗性上的具体应用情况详见表4。

多年来，许多学者发现常规防治措施确实在一定成程度上能局部控制TYLCVD的发生。但从某种意义上讲，培育抗病新品种是控制TYLCVD发生的最有效、最具前景的方法。随着测序技术及高通量基因分型平台的出现，将分子标记辅助选择（MAS）技术与传统的田间选育相结合，可在DNA水平上对育种材料进行筛选，达到加快选育速度、加强选择准确度、提高育种效率的目的。目前，该技术已广泛应用在番茄抗TYLCV育种。基因聚合（gene pyramiding）是指将分散在不同品种的目标基因聚合到一个基因组中，通过这种方式，可在较短的育种周期内培育出集高产、优质、多抗于一体的优良种质资源或品种。基因聚合能显著增强作物抗病、抗虫能力，从而减少化学农药的使用，对生态环境有益。目前，我国的育种工作者相继育成了一系列抗TYLCV及其他病害的优质、多抗番茄新品种品种，如“粤科达301”、“西大樱粉1号”、“郑番1203”、“郑番12158”、“浙粉702”。

4 问题与展望

随着我国设施园艺的迅猛发展，番茄黄化曲叶病毒病已经成为保护地番茄生产的重要病害。今年来，我们对TYLCV逐步深入了解，但仍很多问题有待解决。在“病毒—传毒介体—寄主植物”的循环过程中，作为传毒媒介的烟粉虱，可携带多种病毒，而植株可被多种病害复合侵染，在田间控制烟粉虱种群数量是十分必要的。在今后的番茄生产中，早期病毒检测及针对具体情况制定相应的防控措施，对防治TYLCVD显得尤为重要。

目前，已有研究表明，将病毒外壳蛋白基因及病毒复制相关蛋白基因转入植株，可使其获得抗性[21];另有研究表明，在棉花上表达杀虫蛋白Tma12具有杀虫效果，这些方式都具有很好的前景。针对番茄抗TYLCV，选育抗病品种无疑是最好的选择。

今后的研究主要集中在抗性基因聚合[22]，以及基因沉默和基因编辑等领域。在早期快速检测的基础上，以“预防为主，综合防治”为防控方针，加强抗性资源的开发利用，结合开展分子标记辅助选择（MAS）进行抗性育种，多举措推进实现番茄黄化曲叶病毒病的综合防控，减轻病害造成的经济损失，提高番茄质量安全，促进设施蔬菜产业的健康发展。

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