一株灵芝病原真菌的分离鉴定及生长环境初探

张凤凯 付强 公旭谦 崔波 唐玉琴 徐济责

摘 要：为明确灵芝病原真菌的归属，采用组织分离法[1]获得病原菌株，结合形态学及分子生物学方法对分离菌株进行鉴定，从显微特征和分子生物学对其进行分析鉴定;测定不同温度、pH、光照等条件下对病原菌产孢量、尖端菌丝数量的影响。结果表明：形态学鉴定及分子生物学鉴定为侧耳木霉，通过SPSS数据分析不同温度，pH对病原菌的产孢量与菌丝尖端数量有明显差异，光照则无明显差异。温度在15℃时产孢量为零，温度在15℃与30℃时尖端菌丝数量最少;pH为5与9时产孢量、尖端菌丝数量最少，因此灵芝病原菌为侧耳木霉，温度在15℃与30℃，pH为5与9时对产孢量和尖端菌丝数量影响最大。

关键词：灵芝;侧耳木霉;鉴定;rDNA-ITS序列

Abstract：In  order  to  identify  the  ascription  of  Ganoderma  lucidum  pathogenic  fungi，the  pathogen  strains  were  obtained  by  tissue  isolation method[1].The  isolated  strains  were  identified  by  morphological  and  molecular  biological  methods.The  effects  of  different  temperature，pH  and light  on  the  sporulation  and  the  number  of  hyphae  were  determined.The  results  showed  that  Trichoderma  orientalis  was  identified  as Trichoderma  orientalis  by  morphology  and  molecular  biology.SPSS  data  were  used  to  analyze  the  difference  of  sporulation  and  hyphae  tip number  between  different  temperature  and  pH  value，but  there  was  no  significant  difference  in  light  intensity.At  15℃，the  spore  production was  zero，and  the  temperature  was  15℃  and  30℃，respectively.When  the  temperature  was  15℃  and  30℃，pH  was  5  and  9，and  the  number  of apical  hyphae  was  the  least.Therefore，the  pathogen  of  Ganoderma  lucidum  was  Trichoderma  Pleurotus，the  temperature  of  15℃  and  30℃，pH 5  and  9  had  the  greatest  influence  on  the  sporulation  and  the  number  of  apical  hyphae.

Key  words：Ganoderma  lucidum;Trichoderma  pleuroticola;identification;rDNA-ITSsequence

灵芝（Ganoderma lucidum）属担子菌门，层菌纲，非褶菌目，灵芝科[2]。灵芝中含有大量的多糖，甾醇和三萜类物质，具有扶正固本、增强免疫力功能、提高机体抵抗力的作用[3-6]。曹妮娜等调查蓝山县灵芝栽培中发现青霉病、木霉病、褐腐病与灵芝白僵病四种病害居多[7];解宜林在安徽灵芝病害调查中发现霉菌危害灵芝最为严重，尤其是木霉菌[8];汪义平在安徽省旌德县灵芝病害的調查中发现木霉发病快，危害严重，除此之外，褐腐病、链孢霉、曲霉与黏菌也作为灵芝病害[9]。2015年我国人工代料和段木栽培面积达到15万亩左右，灵芝及孢子粉产量约12万吨，分别约占全球的75%和30%，已成为世界上灵芝的主要生产和出口国[10]。但由于多年使用同一地域栽培，致使严重影响灵芝产量和质量的真菌病害频发，并且已严重制约了灵芝产业的发展。为确定灵芝病害种类进行了形态学及分子生物学鉴定。由于外界环境对致病菌生长影响较大，因此试验测定了不同温度、pH、光照对其生长所产生的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：采集于吉林省蛟河市灵芝种植基地，从灵芝椴中分离获得。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL。试剂：真菌DNA提取试剂盒。仪器：PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离

采用组织分离法对病原菌进行分离纯化。经多次分离纯化，获得5种病原菌编号分别为：0083、0089、0094、0100、0106。经梯度稀释获取单孢病原菌。

1.2.2 致病性测定

将五种单孢病原菌遵循科赫法则[11]进行回接试验。

1.3 形态鉴定

将0094菌接种于PDA培养基;25℃黑暗培养;每隔24h观察并记录菌落的颜色、形状、气生菌丝的疏密程度;72h后镜检分生孢子的形态、大小、着生方式以及分生孢子梗形态等分类特征鉴定菌株的分类地位[12]。

1.4 病原菌分子生物学鉴定

1.4.1 总DNA的提取

参照钟志敏等DNA提取方法[13]。

1.4.2 rDNA-ITS序列的扩增和测定

采用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS1  （5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）、ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）扩增致病菌的ITS和5.8S  rDNA区段。PCR的反应体系为10×PCR  buffer  5μL，dNTP  1μL，ITS1  1μL，ITS4  1μL，Taq  DNA聚合酶0.5μL，模板DNA 10μL，加ddH2O补足50μL。扩增反应程序为：94℃预变性3min;94℃变性30s;52℃退火30s;72℃延伸1min，30个循环;72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、凝胶成像仪检测，将PCR产物送至北京华大基因公司完成测序。

1.4.3 rDNA-ITS序列同源性比较

将0094菌株rDNA-ITS序列在NCBI中BLAST比对，下载相关参照菌株序列。采用MEGA6.0进行同源性分析，获得菌株聚类分析结果。

1.5 温度对菌丝生长、产孢时间及产孢量的影响

以PDA培养基为基础培养基，接种直径为5mm的0094菌饼，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃恒温、黑暗培养，每个处理5次重复。每隔24h测量菌落直径，72h后测定产孢量。

1.6 pH对菌丝生长、产孢时间及产孢量的影响

培养基用0.1mol/L  NaOH和0.1mol/L  HCl调节培养基，使pH为5、6、7、8、9。将直径为5mm的0094菌饼接种于不同酸碱度的PDA培养基上，25℃恒温、黑暗培养，每个处理5次重复。每隔24h测量菌落直径，72h后测定产孢量。

1.7 光照对菌丝生长、产孢时间及产孢量的影响

将直径为5mm的0094菌饼移至PDA培养基上，分别设置连续光照、连续黑暗、交替光照3个处理，25℃恒温培养，每个处理5次重复。每隔24h测量菌落直径，72h后测定产孢量。

2 结果与分析

2.1 致病性

通过回接试验，同灵芝病害比对，确定0094为病原菌。

2.2 菌株的形态学鉴定

病原菌在PDA上产生簇状白色气生菌丝，菌丝同心轮纹，开始为绿灰色，很快转变为灰绿色，后期为暗绿色至黑绿色。菌落背面开始基本无色，随着菌落增长，在PDA上呈现黑褐色。分生孢子梗分枝近似金字塔形，越接近基部分枝越长，分枝单生或者向梗的主轴基部对生，分生孢子梗及其分枝相对狭窄并且呈波曲状。主轴基部宽度为5.5μm，最顶端的分枝圆柱形，大小为6～14×2.5～3.3μm。瓶颈对生，安瓿形，顶部突然变细为瓶颈，着生分生孢子，大小为4.2～9.5×3.0～4.2μm，顶生瓶梗细长，长度可达20μm。分生孢子亚球形至宽椭圆形，大小为2.7～5.0×2.5～3.7μm，显微镜下观察为亮绿色，聚集成团时为黑灰色，壁光滑。厚垣孢子通常呈串或者呈簇，亚球形，直径4～10μm，苍绿色。

2.3 分子生物学鉴定

由图1可知0094的16SrDNA序列与Trichoderma pleuroticola序列的同源性最高，结合形态学鉴定，确定0094菌株为侧耳木霉。

2.3 温度对侧耳木霉菌丝生长、产孢量及尖端菌丝数量的影响

2.4 pH对侧耳木霉菌丝生长、产孢量及尖端菌丝数量的影响

2.5 光照对侧耳木霉菌丝生长、产孢量及尖端菌丝数量的影响

3 讨论

灵芝病害的类型有青霉病、木霉病、褐腐病、链孢霉、曲霉与黏菌等，各种病害的发病率都呈有逐年上升、危害加重的趋势，尤其是霉菌引发的病害。分子生物学鉴定包括rpb2、ITS序列的鉴定，该病原菌ITS序列比对同源性较高，所以优先采用ITS进行同源性分析。外部环境对病原菌生長的影响很大，在椴木栽培灵芝生产中湿度固定，温度难以控制。侧耳木霉主要靠产生孢子传播，因此产孢量的多少对侧耳木霉引发的灵芝病害有影响。其次尖端菌丝数量越多，吸收养分的能力越大，为此试验测定温度、pH、光照三个因素对病原菌的生长速度、产孢量及尖端菌丝数量的影响。结果表明光照条件对侧耳木霉产孢量和尖端菌丝数量无明显影响，病原菌最不适的生长条件为温度在15℃，pH为5或9，但温度过低，pH过酸或过碱会影响灵芝的生长，找到最适宜的温度、pH有待进一步研究。

参考文献

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[7] 曹妮娜，王育娜.蓝田县灵芝栽培中常见病虫害及防治方法[J].食用菌，2015，37（06）：56-57.

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[13] 钟志敏，赖小平，黄松，张桂芳.石斛内生炭角菌DNA提取方法优化及分子鉴定[J].菌物学报，2018，37（01）：73-78.