泰乐菌素高产菌株选育及培养优化分析

张玉 高凤云 谢文婷

摘 要：泰乐菌素是一种专门用于畜禽抗感染和促生长的抗生素，不会引发交叉耐药性问题，而且附加值高，但随着市场需求的与日俱增，需要不断提高其质量与产量。对此，笔者基于弗氏链霉菌TP-116菌种，经复合诱变处理对其作了泰乐菌素粉抗性定向筛选，所得菌株具有良好的遗传稳定性和较高的发酵效价，达到了选育培优的目的。

关键词：泰乐菌素;弗氏链霉菌;诱变

目前泰乐菌素高产菌株培育方法有多种选择，本文则综合利用了微波、紫外线以及氯化锂的诱变方法，以期改善泰乐菌素性能，提高其生产能力，更好的服务于畜禽行业发展。

1 泰乐菌素高产菌株的选育培优实验

1.1 材料要求

首先，选取以具有较强生产能力的弗氏链霉菌TP-116菌株作为本次实验的出发菌。其次，制备平皿与斜面培养基时，控制FeSO4·7H2O、NaCl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KNO3、琼脂、可溶性淀粉配比分别为0.002%、0.1%、0.1%、0.5%、2.0%、3.0%，经纯化水配制后调整pH值为6.8-7.2。再者，制备种子摇瓶培养基时，控制轻质碳酸钙、豆油、冷榨黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉配比分别为0.6%、0.9%、1.2%、1.2%、1.3%，经纯化水配制后调整pH值为6.8-7.2。最后，制备发酵摇瓶培养基时，控制MnCl2、NiSO4·6H2O、（NH4）2HPO4、盐酸甜菜碱、Na Cl、KCl、轻质碳酸钙、棉籽蛋白、麸质粉、鱼粉、玉米淀粉、豆油分别为0.0026%、0.0036%、0.12%、0.15%、0.5%、0.5%、0.6%、1.3%、1.68%、2.08%、3.21%、6.2%，经纯化水配制后调整pH值为6.9-7.3。

1.2 培养条件

泰乐菌素高产菌株的选育在不同阶段需要不同的培养条件，其中斜面培养要求保证28±0.5℃的培养温度、20-50%的相对湿度以及300-420h的培养时间;种子摇瓶培养要求保证28±0.5℃的培养温度、20-50%的相对湿度、36-42h的培养时间以及360±20rpm的转速;发酵摇瓶培养则需要保证27±0.5℃的培养温度、35-50%的相对湿度、200-240h的培养时间以及360±20rpm的转速[1]。

在此基础上选取ODS柱为色谱柱，以氯化钠（0.85mol/L）和乙腈溶液（40%）为流动相，经盐酸（1mol/L）调整pH值为2.5后，配以290nm的检测波长和1mL/min的流速，根据（标准品单位·待测样品峰面积·待测样品稀释倍数）/标准品峰面积=待测效价这一公式测定泰乐菌素的效价[2]。

1.3 诱变处理

1.3.1 复壮处理原始菌株

完成孢子悬液制备后将无菌水加入其中进行稀释至1×10-5，随后吸取每个培养皿中稀释的孢子悬液20μL在平皿培养基平板中均匀涂布，使其在27℃温度下培养5d，选择其中的单菌落用于摇瓶初筛与复筛，统计复壮数据。

1.3.2 紫外线诱变菌株

量取10mL制备好的孢子悬液置于灭菌平皿（直径10cm）中，先对15W额定功率的紫外线灯进行25min的预热，设置253.7nm的波长，随后将上述平皿置于磁力搅拌器上，与灯管保持30cm的距离，打开平皿盖分别控制照射时间为0s（对照组）、30s、60s、90s、120s，并对泰乐菌素的致死率与正突变率加以计算和统计。

1.3.3 微波诱变菌株

量取10mL孢子悬浮液，注入10cm直径的平皿中，设定微波炉脉冲频率、运行功率分别为2450MHz和800W后辐照孢子悬液，处理时间分别为0s（对照组）、20s、40s、60s，并对泰乐菌素的致死率与正突变率加以计算和统计。

1.3.4 复合诱变菌株

以TP-108泰乐菌素菌株为对象，对其单孢子菌悬液进行紫外线诱变与微波诱变，经合理稀释后涂布于平皿培养基中，且该培养基中含有氯化锂0.2%，并按要求设置对照组。

1.3.5 抗性定向筛选

稀释诱变后的孢子悬液，随后将其分别涂布于浓度一定的泰乐菌素培养基平板上，置于27℃温度下培养6d，用于泰乐菌素抗性突变菌株的筛选。在后期测定遗传稳定性时，需斜面保存高产菌株，待孢子产生后经接种竹签刮取少量移至另一斜面作为一代，按照上述操作直至传代4次，结束后一同对4代菌株进行发酵培养，测定遗传稳定性，重复3次。

2 泰乐菌素高产菌株的选育培优结果

2.1 复壮与诱变结果分析

分析原始菌株复壮数据可知，初筛与复筛后效价较高的单菌落有5个，经平板3次分离与3次转接后得到了具有最高发酵效价的TP-108菌落，并将其作为诱变处理对象。出发菌株经不同诱变处理后的结果不尽相同，其中经紫外线60s照射和微波照射40s双重诱变处理下的摇瓶效价最高，泰乐菌素的正突变率也最高。而菌株TP-108孢子悬浮液在紫外线和微波分别照射60s和40s加以诱变的基础上稀释，再涂布于含有0.2%氯化锂的斜面培养基所得摇瓶效价提高了9%左右。

2.2 筛选泰乐菌素突变株

第一，先在培养基加入浓度不同的泰乐菌素粉，随后涂布制备的孢子悬液至不同的斜面培养基平板上，置于27℃温度下培养6d，在对所有平板中菌落的生长情状况进行观察的同时记录未长菌落的泰乐菌素的最小作用浓度，以此得到其对弗氏链霉菌抑制浓度的最低值。第二，为获得泰乐菌素高产菌株，本次实验需要在紫外线等复合诱变的同时加入泰乐菌素粉加以定向筛选，即选择YB-08菌株为出发菌株，在培养基中加入浓度不同的泰乐菌素粉，随后稀释孢子悬液将其分别涂布于不同的平皿培养基平板上，置于27℃温度下培养6d，观察并记录菌落的生长情况，得到0.1、0.3、0.6、1、3、5（μg/mL）的泰乐菌素粉的生长情况分别为好、一般、差、无菌落、无菌落、无菌落，说明筛选平板上YB-08菌株的单菌落数量会随着泰乐菌素粉浓度的增加而逐渐减少，当其达到1μg/mL时便无单菌落出现，故泰乐菌素粉对YB-08菌株的抑制浓度最小值为1μg/mL。第三，在含有1μg/mL浓度泰乐菌素粉的斜面培养基平板上涂布稀释后的YB-08菌株，得到抗性突变株共150株，经摇瓶初筛后发现效价高于YB-08出发菌株的抗性株为30株，于是将其移至斜面作摇瓶复筛处理，测得抗性突變株的平均效价有所提高，较之原始菌株提高幅度高达25%。

2.3 高产突变株的稳定性

为进一步验证泰乐菌素高产突变株是否符合高产优质的条件，在此就其稳定性进行了试验。即借助泰乐菌素粉抗性筛选操作得到YBT-06、YBT-12、YBT-20三株优良菌株，将其保存于斜面用于生产孢子，经接种竹签刮取少量孢子移至另一斜面作为一代，如此传代4次，结束后一同对4代菌株进行发酵培养，测定遗传稳定性，重复3次。最终得到如下数据，即YBT-06的初始、第一代、第二代、第三代、第四代的效价（μg/mL）分别为11066、10000、9986、11036、11068;YBT-12的初始、第一代、第二代、第三代、第四代的效价（μg/mL）分别为11200、9632、8798、7692、7356;YBT-20的初始、第一代、第二代、第三代、第四代的效价（μg/mL）分别为11320、10021、9365、8342、7863。分析可知，初筛所得的正突变菌株经传代复筛后部分菌株出现退化，说明泰乐菌素高产菌株遗传特性不太稳定，容易退化，而在传统复合诱变法的基础上加入泰乐菌素粉抗性筛选法，不仅解决了诱变随机筛选的不定向和盲目性的问题，改善了工作效率，还筛选出了YBT-06这一泰乐菌素高产菌株，且其摇瓶发酵效价高于原始菌株25%，为泰乐菌素的优质高效生产奠定了良好的基础。

3 结束语

本文通过紫外线、微波与氯化锂诱变处理弗氏链霉菌，结合使用泰乐菌素粉抗性定向筛选，最终所得高产菌株生产力强、发酵效价高、遗传稳定性好，符合选育培优的条件，值得借鉴和推广。

参考文献：

[1]刘鹏，徐雪风，陆建中，王维兴.泰乐菌素高产菌株诱变选育[J].当代化工研究，2019（15）：111-112.

[2]丁亚莲，李春玲，党红娟，高宏伟，张萍.应用基因组重排技术提高泰乐菌素产量[J].中国抗生素杂志，2017，42 （10）：902-909.