神经性布氏杆菌病树鼩模型建立及间充质干细胞治疗实验教学初探

[摘 要] 尝试应用鼻腔灌注法及颈背部注射法建立树鼩神经性布氏杆菌病模型，通过临床观察，以期探索建立一个病理过程、临床表现与人类疾病相类似的布氏杆菌病动物模型的方法，用于该病的致病机理、药物筛选评价等实验研究，为神经性布氏杆菌病的发病机制研究及药物研发工作提供新的思路。

[关键词] 神经性布氏杆菌病;树鼩;间充质干细胞;实验教学

[课题项目] 2019年度河套学院科学研究项目“神经性布氏杆菌病树鼩模型建立及间充质干细胞治疗的实验研究”（HYZY201940）

[作者简介] 刘立飞（1986—），内蒙古通辽人，河套学院医学系讲师，主要从事外科护理学、急救医学、护理管理研究。

[中图分类号] G642.0    [文献标识码] A    [文章编号] 1674-9324（2020）34-0259-02    [收稿日期] 2020-02-24

一、神经性布氏桿菌病树鼩模型建立及间充质干细胞治疗实验教学概述

布氏杆菌病（Brucellosis）又称为布鲁氏菌病，是布氏杆菌感染引起的人畜共患传染性疾病。布氏杆菌属的细菌是一组微小的革兰阴性菌，它可经多种传播途径感染人类，随血液带至全身，造成菌血症、毒血症和败血症。在我国，布氏杆菌病和流行性脑膜炎、肺结核、登革热等传染病一同列入乙类传染病。内蒙古自治区作为全国畜牧区，是我国人畜布氏杆菌病疫情最为严重的地区之一。

布氏杆菌病临床表现十分复杂，神经系统病变是其局限性损害的表现。已报道的中枢神经系统病变有脑膜脑炎、脑膜炎、脊髓炎、脑脊髓膜炎、硬脑膜外脓肿、脑脓肿（包括垂体脓肿）、脑梗死、短暂性脑缺血发作、蛛网膜下腔出血、白质脑病、颅内静脉系统血栓形成及精神异常等。

由于脊柱脊髓损伤的高致残率，给家庭和社会造成沉重的负担，传统的治疗主要依靠药物和外科手术，虽然可在一定程度上缓解，但疗效有限，多局限在病症的缓解，无法从根本上解决病患的问题，因此其治疗至今仍然是一个世界性难题。干细胞移植治疗脊髓损伤，使损伤轴突再生、突触重建和恢复脊髓部分功能成为可能，而间充质干细胞，特别是骨髓来源的间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）除了具有干细胞的一般特性外，相比其他类型的干细胞，还具有取材方便、不涉及伦理问题、易于外源基因转染及稳定表达、免疫原性弱、可进行自体移植、尚未发现致瘤性等诸多优点，在医学上被认为是一种细胞替代治疗及基因治疗的理想靶细胞，尤其是在神经系统损伤修复领域，有着良好的应用前景。

二、神经性布氏杆菌病树鼩模型建立及间充质干细胞治疗实验教学方法

（一）建立树鼩神经性布氏杆菌病模型

1.布鲁氏杆菌培养及菌液制作。实验分组和模型制备。

2.检测指标。（1）行为学检查;（2）磁共振成像检查;（3）病原学检查;（4）组织病理学检查。

3.统计分析和模型评价。

（二）树鼩星形细胞与少突胶质细胞的体外原代培养及其在布氏杆菌感染作用下炎症因子早期的变化研究

细胞培养：体外分离培养树鼩角膜星形细胞与少突胶质细胞。（1）初步感染：实验组细胞分别接受107、108和109CFU/ml三种浓度的菌悬液感染，分别吸取不同浓度的菌悬液20ul，滴加于实验细胞培养液中;对照组滴入20ul磷酸盐缓冲液（PBS）。（2）检测指标：在感染操作后12h、1、3、5分批使用Trizol法提取细胞总RNA，用于RT-PCR实验，检测实验细胞中TNF-α、IL-12、IL-8、IL-1β、IL-6的蛋白表达。

（三）树鼩间充质干细胞体外分离培养

（四）间充质干细胞治疗树鼩神经性布氏杆菌病脊髓损伤的神经系统变化研究

1.实验分组：选取树鼩20只，随机分为模型组、生理盐水组。

2.实验方法：选取行为学表现较差、且磁共振成像脊柱损伤的实验动物，经静脉途径将体外分离培养后的BMSCs注射入体内，对实验动物进行行为学观察并评估，且注射后定期对实验动物脊柱进行磁共振成像检查。

3.检测指标：在手术操作后定期分批处死动物。采集脑组织、脊髓标本，用于RT-PCR实验，检测实验动物脑组织及脊髓中的炎症因子表达变化TNF-α、IL-12、IL-8、IL-1β、IL-6的表达变化情况。接种后5、10、15、20和30d应用过量麻醉法分批处死实验动物，取实验动物脑组织及脊柱进行HE染色观察病理改变，PAS染色观察神经系统组织间的细菌菌灶，透射电镜观察角膜超微结构改变。对间充质干细胞治疗结果做简单评估。

三、研究与讨论

由于神经性布氏杆菌病是一种严重致瘫性疾病，我国神经性布氏杆菌病患者中绵羊和山羊种（B.melitensis），是最常见的致病病原菌，临床早期正确诊断和治疗存在一定困难，治疗后存在感染复发的可能性。我区农牧业人口居多，牧区面积大，布氏杆菌病患者很常见。对于布氏杆菌病来说，寻找一种低成本、再现性好、复制率高的理想动物模型有利于推动该疾病的相关研究。

目前常用作实验动物的小鼠和兔神经系统与人类神经系统存在差异，不利于重现人类神经性布病的临床表现。树鼩隶属于攀鼩目树鼩科树鼩属，为外形类似于松鼠的一类小型哺乳类动物，体型较小，体重≤320g，广泛分布于东南亚、南亚及我国南部。树鼩比较容易饲养管理，繁殖快，价格低廉，其新陈代谢较鼠类和犬类等动物更接近于人，大体解剖也近似于人。最近，昆明动物研究所组织了中缅树鼩全基因组测定和解析工作，得到了高覆盖度（79X）的基因组序列。通过基因组分析，发现树鼩在神经及免疫系统等方面与人类具有较为高度的同源性，在很多方面具有可用来替代猕猴等大型灵长类实验动物的遗传基础，可能还适合于更多的免疫学、神经生物学及代谢等生物学问题和疾病机理研究（Fan et al，2012）。

本研究通过临床观察、磁共振成像检查、组织病理学检查、病原学检查、透射电镜超微结构观察等对造模的成功率、与人类疾病的相似程度进行评价，检测感染过程中相关的炎性因子的变化，探索建立一个病理过程、临床表现与人类疾病相类似、价格低廉、技术简单、成功率较高的布氏杆菌病动物模型的方法，用于该病的致病机理、药物筛选评价等实验研究，在感染后期进行初步探讨甘露糖受体（MR）和Dectin-1在神经性布病的发生发展中的作用，为神经性布病的发病机制研究及药物研发工作提供新的思路。

参考文献

[1]李振宇，陈玲霞，尹博文，等.骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的研究进展[J].实验动物科学，2015，32（3）：56-61.

[2]黄霞，潘兴华，庞荣清，等.树鼩2型糖尿病模型的构建及其相关因素分析[J].西南国防医药，2015，25（8）：834-837.