响应面优化超声辅助提取巧克力中矿物油工艺及检测

赵晓丹，李巧玲

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018）

矿物油（mineral oil）作为石油的副产物，常被称为白油或者是石蜡油[1]。由于其被人体摄入易在体内富集，所以食用掺有一定量矿物油的食品就会对人体造成危害。食品中矿物油和传统意义上的污染物有所不同，不仅不易挥发而且组成非常复杂，是C10～C50烃类化合物总称，主要分两大类，一类是以多芳香化合物形式存在的芳香烃矿物油（mineral oil aromatic hydrocarbons，MOAH），另一类为饱和烃矿物油（mineral oil saturated hydrocarbons，MOSH），其具有支链、直链和环状结构[2-4]。其中，致癌和致突变的主要来源是具有4～6环结构的多环芳烃矿物油[5-7]。矿物油的毒性和它的黏度已证明存在一定的关系，黏度越高的矿物油毒副作用越不明显，而有非常明显毒害作用的是低黏度矿物油[8-9]。

目前，国际上检测矿物油多采用液相色谱与气相色谱联用，国内刘玲玲等[10]建立了高效液相色谱-气相色谱联用测定稻谷和大米中饱和烃矿物油（MOSH）的方法，但该检测方法仪器昂贵，无法普及。刘亮等[11]采用气相色谱-质谱法检测鸡肉中的矿物油，虽然质谱定量准确，但是矿物油结构复杂，信息不足，难以定量。本文对巧克力中矿物油进行超声辅助提取，并进一步通过响应面法优化，得到最优提取工艺，分离纯化时用硝酸银硅胶固相萃取柱，检测时采用气相色谱（gas chromatography，GC）（配备氢火焰离子化检测器），该提取检测方法操作简单，定量准确，对试验条件和仪器要求不高，可为后续食品中矿物油的日常提取检测提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

气相色谱仪（GC-7820A，配备氢火焰离子化检测器）：美国 Agilent公司；超声波清洗器（SK5200LHC）：上海科导超声仪器有限公司；高速冷冻离心机（KDC-160HR）：安徽中科中佳科学仪器有限公司。

正己烷（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；硅胶（0.063 mm～0.200 mm）：上海麦克林生化科技有限公司；C7～C40正构烷烃混合标准溶液、环己基环己烷（cyclohexylcychlohexane，Cycy，用作内标）：美国Sigma-Aldrich公司；AgNO3（分析纯）：上海精细化工材料研究所；巧克力：市购。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液

10 mg/mL内标储备液中准确移取0.5 mL于25 mL棕色容量瓶内，用正己烷定容，得浓度为200 mg/L的内标使用液。

准确移取浓度为1 mg/mL的C7～C40正构烷烃混合标准溶液1 mL于5 mL的棕色容量瓶中定容，得到200 mg/L标准工作液；以此方法分别配制200、40、8、1.6 mg/L以及0.32 mg/L的系列标准工作液[12]。

1.2.2 矿物油的提取工艺及优化

准确称取3 g切碎的巧克力样品于锥形瓶中，以正己烷为溶剂，加入30 μL内标使用液，在超声辅助条件下对样品提取3次，然后将其离心15 min（转速8 000 r/min），取上清液氮吹浓缩至2 mL，得样品提取液[13]。

1.2.2.1 矿物油提取的单因素试验

根据预试验，分别设定超声辅助提取时间25 min、温度30℃、料液比 1∶3（g/mL）、功率 120 W，采用控制变量法考查不同条件下巧克力样品中矿物油提取量的变化。

1.2.2.2 响应面优化矿物油提取工艺

在前期的单因素试验结果基础上，选取单因素试验中各最佳因素条件为中间水平，以矿物油提取量为响应值，设计四因素三水平的Box-Behnken试验方案[14]，如表1所示。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Experimental design and variable levels for Box-Behnken

1.2.3 样品净化

按文献[15]制备固相萃取柱（solid phase extraction，SPE）柱，将玻璃纤维滤纸放入5 mL玻璃注射器底部，加入3 g 0.3%银渍硅胶后敲实，银渍硅胶表面再放一层玻璃纤维滤纸。用10 mL正己烷淋洗，弃去流出液，待液面接近填料时，加入1.2.2中的2 mL提取液，以15 mL正己烷洗脱，弃去最初2 mL洗脱液，收集后续10 mL，氮吹浓缩至1 mL，备用。

1.2.4 色谱条件

1.2.5 检出限和定量限

将标准工作液进一步稀释，相同条件下取各低浓度的工作液检测6次，由yd=3.3×σb，yq=10×σb可得检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ），式中：yd、yq分别为 LOD、LOQ 处的信号响应值；σb为标准曲线最低浓度点的标准偏差[16]。

表2 色谱条件Table 2 Chromatographic conditions

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 提取时间对矿物油提取量的影响

提取时间对矿物油提取量的影响见图1。

图1 提取时间对矿物油提取量的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction quantity of mineral oil

由图1可知，随提取时间增加，矿物油提取量增加，但当超过25 min后，提取量略有减少。主要因为提取时间越长，越有利于巧克力中矿物油扩散至提取液中，达到平衡后继续增加提取时间将会增加体系的不稳定性，导致提取量降低[17]。考虑到实际应用，在后续响应面优化试验中选提取时间为20 min～30 min。

2.1.2 提取温度对矿物油提取量的影响

提取温度对矿物油提取量的影响见图2。

常州市人才工作起步较早，党管人才工作运行机制完善，人才队伍建设政策体系和服务体系相对完善，人力资源发展氛围好、基础扎实。截至2016年年底，全市人才总量达到106.2万人，其中高层次人才6.28万人，高技能人才26.2万人，分别比2010年增加了68.04%，117.29%，142.17%。2015年，每万人口中大学本科及以上学历人数219人，位列全省第三；每万从业人员中研究与发展（R&D）人员数233人，位列全省第二。企业R&D活动人员占企业职工比重6.78%，R&D活动人员占科技活动人员比重67.82%，位列全省第五。

图2 提取温度对矿物油提取量的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction quantity of mineral oil

从图2中可以看出，当提取温度未超过30℃时，矿物油提取量随温度升高而快速上升，在此之后温度升高提取量开始下降。虽然温度升高有助于加速分子运动，但是当体系达到平衡后，温度对矿物油提取量的影响不明显，反而会使溶剂挥发且浪费热源，此外高温还可能导致矿物油的挥发，因此将20℃～40℃作为理想的提取温度进行后续优化。

2.1.3 料液比对矿物油提取量的影响

料液比对矿物油提取量的影响见图3。

图3 料液比对矿物油提取量的影响Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction of mineral oil

根据图 3 可知，在料液比在 1∶1（g/mL）～1∶3（g/mL）范围，矿物油提取量逐步增加，当溶剂体积超过3倍时，提取量略有下降。由于溶剂添加量太少，提取物溶出困难，导致提取量不高；当溶剂添加量过多时，超声空化作用减小；另外溶剂体积过大，造成资源浪费，且后续氮吹浓缩时间变长，导致矿物油损失[18]。由此可见，应将 1 ∶2（g/mL）～1∶4（g/mL）作为理想的料液比范围进行后续响应面优化。

2.1.4 超声功率对矿物油提取量的影响

超声功率对矿物油提取量的影响见图4。

图4 超声功率对矿物油提取量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction of mineral oil

由图4中看出，超声功率介于80 W～120 W之间，矿物油提取量逐步增加，此后提取量呈下降的趋势，可能由于超声有其独特的力学、热学及空化效应等物理化学效应会对矿物油提取量造成一定的影响。因此选择100 W～140 W作为理想的超声功率范围并进行后续响应面优化。

2.2 响应面法优化试验

利用Design-Expert进行试验设计及数据处理，试验结果见表3，拟合表中数据，建立数学模型，得到回归方程为：Y=4.63+0.29A+0.10B+0.40C-0.11AB-0.044AC+0.13AD-0.032D+0.018BC-0.096BD-0.020CD-0.60A2-0.70B2-0.53C2-0.61D2。

表3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken

回归模型方差分析见表4。

由表4可知：模型P＜0.000 1，失拟项P=0.058 8，说明这个二次方程模型极显著，回归模型拟合度好，试验误差小。其中R2=0.983 1＞0.9，试验模型的校正系数R2Adj=0.966 1，说明可以用此模型对巧克力中提取矿物油进行分析和预测。结果表明，该模型中A、D、A2、B2、C2、D2和B、AD对矿物油提取量影响分别达到极显著水平和显著水平[19]。

表4 回归模型方差分析表Table 4 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

各因素交互作用对矿物油提取量的响应面图见图5。

由图5及F值大小得各因素对矿物油提取量影响主次顺序为料液比＞提取时间＞提取温度＞超声功率。以试验模型预测时间、温度、料液比和超声功率最佳条件分别为：26.125 min、34.75 ℃、1 ∶3.225（g/mL）和117 W，在此条件下矿物油提取量达到最大值3.215 mg/kg。为进一步验证该模型的有效性，同时结合仪器条件将最佳条件分别修改为：26 min、35℃、1 ∶3.2（g/mL）和 120 W，该条件下，矿物油提取量达3.127 mg/kg，和预测值3.215 mg/kg基本一致，其中相对偏差为2.74%，说明模型很好地预测了矿物油提取量，该优化工艺条件相对可靠[20-21]。

2.3 矿物油定性及定量分析

在1.2.4色谱条件下C7～C40正构烷烃混合标准溶液和巧克力中矿物油的色谱图如图6所示。

正构烷烃C9～C40的分子式、分子量及标准曲线方程见表5。

图5 各因素交互作用对矿物油提取量的响应面图Fig.5 The response surface map of the interaction of each factor to the extraction amount of mineral oil

图6 GC色谱图Fig.6 GC spectra

表5 正构烷烃C9～C40的分子式、分子量及标准曲线方程Table 5 Molecular formula，molecular weight and standard curve of normal paraffin C9～C40

续表5 正构烷烃C9～C40的分子式、分子量及标准曲线方程Continue table 5 Molecular formula，molecular weight and standard curve of normal paraffin C9～C40

由于C7、C8发生挥发损失，未检测出相关谱图，以GC谱图中C9～C40正构烷烃混合标准工作液的峰面积（y）与相应浓度（x）绘制曲线，所得相应标准曲线的相关系数均趋近于1，说明C9～C40正构烷烃混合标准工作液在0.32 mg/L～200 mg/L浓度范围内线性关系良好。

采用标准曲线和内标法结合法进行定性定量分析，得到待测样品中矿物油种类及含量，内标法计算待测样品中矿物油含量（mi）公式如下：

mi=f×Ai（As/ms）

式中：Ai和As分别为待测样品中矿物油和内标物的峰面积或峰高；ms为加入内标物的量，mg/L；f为相对校正因子。

f=（As/ms）/（Ar/mr）

式中：As和Ar分别为内标物和混合标准溶液中矿物油的峰面积或峰高；ms和mr分别为加入内标物和混合标准溶液中矿物油的量，mg/L[22]。

2.4 检出限和定量限

由1.2.5计算得该检测方法的LOD和LOQ分别为0.26 mg/kg和0.78 mg/kg，可满足日常检测需求。

2.5 加标回收率

在试验1.2的基础上，将巧克力作为基质，分别添加 1.5、3.0、6.0 mg/kg 的 C7～C40正构烷烃混合标准溶液进行加标回收试验并检测，得加标回收率为85.2%～97.4%，相对标准偏差在0.37%～1.33%之间，满足分析检测的要求[23]。

2.6 样品分析

对市售的10种巧克力样品进行分析检测，结果见表6。

结果表明，10种巧克力样品中均能检测到矿物油，平均含量介于1.047 mg/kg～7.073 mg/kg之间，其中2号和6号样品中矿物油含量较高，污染来源可能是生产过程中使用含有矿物油的脱模剂和防黏剂，也可能源于包装材料上矿物油的迁移。但是目前国内对巧克力中矿物油含量没有明确的限量要求，随着人们对矿物油毒理学的认识，巧克力中矿物油污染问题逐渐引起了广泛的关注。

表6 不同巧克力样品中的矿物油含量Tab.6 Mineral oil content in different chocolate samples

3 结论

本研究采用超声辅助提取巧克力中的矿物油，并通过响应面优化，得最佳提取条件：提取时间26 min，提取温度35℃，料液比1∶3.2（g/mL），超声功率120 W。气相色谱检出限为0.26 mg/kg，定量限为0.78 mg/kg，加标回收率为85.2%～97.4%，相对标准偏差在0.37%～1.33%之间，采用该提取检测方法测定了市售10种巧克力样品中的矿物油含量，结果表明，10种巧克力样品中均存在矿物油污染的情况，矿物油平均含量介于1.047 mg/kg～7.073 mg/kg之间，本课题组将继续深入研究探讨巧克力中矿物油的污染和迁移问题，为食品监管及立法提供数据支持。