ANA及ANAs在原发性血小板减少症患者诊断中的应用

何栋，黎杨杨，陈冬玲

(阳江市人民医院检验科，广东 阳江 529500)

对人体来说，当出现不明原因导致的血小板水平低于正常值时，就会造成人体出现出血倾向[1]。患者主诉皮肤粘膜出血、消化道出血等症状入院就诊，临床医生通过对患者进行一系列检查后，可诊断出患者患有血小板减少症，但因为找不到患者血小板减少病因，将患者病症归为原发性血小板减少症[2]。由于原发性血小板减少症造成严重出血情况会使人体受到极大的危害，所以对于原发性血小板减少症，要高度重视并积极选用科学的治疗方法和预后措施[3～4]。因此针对于该病检测显得尤为重要，目前针对原发性血小板减少症患者检测手段众多，对于该病患者进行ANA及ANAs检测研究相对较少。本文主要探讨抗核抗体(anti-nuclear antibody，ANA)及抗核抗体谱(antinuclear antibody spectrum，ANAs)在原发性血小板减少症患者诊断中的应用研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取在2016年1月至2020年3月期间我院收治的114例初步诊断为原发性血小板减少症的患者作为研究对象。年龄范围3～91岁，平均(51±6.86)岁，男性40例，女性74例。患者在一般资料上几乎无差异。

纳入标准：(1)临床诊断与原发性血小板减少症诊断标准相符合[5-6]；(2)无恶性肿瘤、其他内分泌疾病等合并疾病情况；(3)向患者及家属讲解此次研究，获得患者与家属同意。排除标准：(1)患者存在严重精神病史或表达功能严重丧失；(2)具有严重的心肝肺脏器疾病者。

1.2 方法

患者检测前需要禁食12 h后采集空腹外周静脉血5 mL。采血完成后要及时对标本标记，并以3000 r/min离心10 min，分离血清后冷冻保持待测，间接免疫荧光方法检测ANA阳性率，欧盟印迹法测定ANAs阳性率，包括测定ANAs中的抗SSA、抗Ro-52、抗SSB、抗NRNP、抗核糖体P蛋白、抗Sm、抗Scl-70、抗Jo-1阳性率。步骤如下：

ANA检测：(1)试剂盒开封后，置于室温下进行20～30 min平衡；(2)1∶100稀释血清标本。每次实验均需加入阳性和阴性对照。对照血清使用前必须混匀；(3)在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。使用聚苯乙烯加样板；(4)将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。室温(18 ℃～25 ℃)温育30 min；(5)将20 μL荧光标记的抗人球蛋白加入洁净加样板的每个反应区。完全加完所有的二抗后，方可继续温育。从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载5 s内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。注意避免阳光直射载片。室温(18 ℃～25 ℃)温育30 min。用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5 min。可在每150 mL磷酸盐缓冲液中加10滴伊文氏蓝进行复染；(6) 结果评估，荧光显微镜下观察荧光。若细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。(待测血清按照1∶100、1∶320、1∶1000、1∶3200这4个滴度进行测试)

ANAs检测：(1)预处理：取出所需的膜条，将其放入温有槽内。膜条上有编号的一面朝上，所有样本均进行稀释处理。加1.5 mL的样本缓冲液于温育槽中，置于室温下(18 ℃～25 ℃)摇摆摇床上进行5 min温育，除去剩余液体；(2)血清进行温育：加1.5 mL血清样本于温育槽，置于室温(18 ℃～25 ℃)下摇摆摇床上进行30 min温育；(3)温育槽清选：除去槽内多余液体，加1.5 mL清洗缓冲液于温育槽中，置于室温下(18 ℃～25 ℃)摇摆摇床上进行5 min膜条清洗，分3次进行；(4)酶结合物育：加1.5 mL酶结合物样本于温有槽中，置于室温(18 ℃～25 ℃)下摇摆摇床上进行30 min温育；(5)温育槽清选：除去槽内多余液体，加1.5 mL清洗缓冲液于温育槽中，置于室温(18 ℃～25 ℃)下摇摆摇床上进行5 min膜条清洗，分3次进行；(6)底物温有：加1.5 mL底物液于温有槽中，置于室温(18 ℃～25 ℃)下摇摆摇床上进行10 min温育；(7)终止：除去槽内多余液体，加蒸馏水于温育槽中，置于室温下(18 ℃～25 ℃)摇摆摇床上进行1 min膜条清洗，分3次进行；(8)结果评估：在进行结果判定的模板中放置检测膜条，风干后进行评估判定。检测质量控制程序：在检测膜条的质控带处，若质控带相应抗原位置发生显色反应，则操作正确(待测血清按照1∶100、1∶320、1∶1000、1∶3200这4个滴度进行测试)。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 ANA及ANAs测定结果比较

所有患者进行检测后发现，ANAs阳性率44%明显高于ANA阳性率37%，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 ANA及ANAs测定结果比较

2.2 ANA及ANAs测定结局比较

所有患者进行检测后发现，进行ANAs检测，患者的确诊率为88%，明显高于进行ANA检测患者的确诊率16%，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 ANA及ANAs测定结局比较

2.3 ANAs呈现阳性患者相关抗体阳性率比较

在ANAs中的抗SSA、抗Ro-52、抗SSB、抗NRNP/SM、抗核糖体P蛋白、抗Sm、抗Scl-70、抗Jo-1中，抗SSA阳性率表达，见表3。

表3 ANAs呈现阳性患者相关抗体阳性率比较

3 讨 论

血小板减少症是指负责人体凝血功能，存在于外周血中的血小板水平低于人体正常值，导致人体出现出血倾向或凝血障碍，发生自发性出血症状[7-8]。症状轻微的患者，基本不会对生活造成影响，但病情较重的患者会出现皮肤粘膜出血、牙龈出血、女性月经期间出血量增多，甚至有的患者会出现脑出血，内脏自发性出血等危及生命的症状，因此一旦发生血小板减少症，要高度重视并科学的进行治疗和预后[9-11]。临床上将血小板减少症分为原发性和继发性两种，继发性血小板减少症是在人体出现器脏疾病、自身免疫疾病、感染、肿瘤等疾病时的并发症状，经过完善医疗检查就可找到病因，对症下药治疗后，患者血小板减少得以缓解[12]。但原发性血小板减少症在排除上述症状后通常无法找到病因，该病发病机制与遗传、免疫系统紊乱等复杂因素有关[13]。由于该病具有病程长，可反复等难以控制的因素，需要患者长期进行专业的治疗和随访，对患者生活和健康造成严重影响。

为了及时掌握原发性血小板减少症患者健康情况，对该病患者开展有效治疗和预后措施，近年来，临床对原发性血小板减少症诊断开辟了多种检测方式。ANA是对细胞核内遗传物质、蛋白质等分子复合物产生的自身抗体，存在于IgG中，由于其具有能识别各种细胞核组分，能特征性地出现于许多自身免疫性疾病中，当ANA呈现阳性时，可判断如原发性血小板减少症及相关自身免疫疾病的活动性及预后，观察治疗反应，指导临床治疗。ANAs是抗核抗体的一种总称，它主要包括3种不同的抗体：DNA、组蛋白以及非组蛋白。主要就是种属不同。ANAs的检测，其阳性表达不仅能诊断一些结缔组织病，还能有针对性检测出特异性抗体。抗ssa、ssb、Ro-52抗体是干燥综合症的一种抗体[14-18]。抗Jo-1抗体是皮肌炎的标记性抗体[19]。抗scl-70抗体是系统性硬化的标记性抗体等。在本次研究中，所有患者通过间接免疫荧光方法对ANA进行检测，欧盟印记法对ANAs进行检测，对比分析发现，ANAs阳性率44%明显高于ANA阳性率37%，说明ANAs特异性更高。对所有患者最终确诊为原发性血小板减小症患者确诊率进行比较ANAs确诊率88%明显高于ANA确诊率16%，同时ANAs呈阳性患者中抗抗SSA、抗Ro-52、抗SSB、抗NRNP/SM、抗核糖体P蛋白、抗Sm、抗Scl-70、抗Jo-1中等8种抗体，其中抗SSA阳性率为80%，说明ANAs谱中抗SSA分布最广，原发性血小板减少症中没有表达的抗体有抗Scl-70、抗Jo-1。通过统计对比还发现ANAs抗体中联合表达阳性率为36%明显高于单项表达阳性率17%，说明各抗体间存在一定关联。

在原发性血小板减少症临床诊断体会：在临床诊断原发性血小板减少症过程中，由于该病病因复杂，在对患者进行完善医学检查，排除其他疾病病因后，需要进行自身抗体检查，而在进行ANA及ANAs检测时，单一检测ANAs患者最终确诊率显然比进行ANA检测高，但当联合进行ANA及ANAs检测时，患者确诊率比任何单一检查确诊率更高。因此，对于原发性血小板减少症患者进行ANA及ANAs联合检测，能减少漏诊率。

综上所述，对原发性血小板减少症患者进行ANA及ANAs检测，能提高阳性检出率，保障患者检测效果有效，对临床诊治具有实用有效价值。