索拉非尼联合二甲双胍对胃癌HGC-27细胞增殖的协同抑制作用

钱越，刘佳，李智，周磊，戴红良

(1.锦州医科大学生命科学研究院；2.辽宁铁道职业技术学院；3.锦州医科大学转化医学研究院；4.锦州医科大学护理学院，辽宁 锦州 121000)

胃癌(gastric cancer，GC)是全世界最常见的癌症之一，尽管20世纪中的发病率在世界范围内有所下降，但其仍然是威胁人类生命的主要病症，同时也是东亚地区最常见的癌症。二甲双胍作为一种上市已久的“老药”近年来被证明在降低癌症发病率和死亡率方面发挥出了积极作用，将其作为一种辅助抗癌药物非常可行[1-2]。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，可以用于治疗多种肿瘤疾病，包括乳腺癌、甲状腺癌、肾细胞癌等。作为一种治疗晚期肝癌的一线用药，索拉非尼可以通过阻断Raf/MEK/ERK信号通路达到治疗效果[3]。由于抗肿瘤药物毒副作用较大，使得肿瘤的治疗步履维艰，特别是单一药物治疗由于药物剂量较大等原因使很多患者难于忍受。因此联合使用其他药物，在起到良好治疗效果的同时减少抗肿瘤药物的用量，成为了科研工作者的研究目标。有文献报道，索拉非尼联合二甲双胍具有一定的联合抗肿瘤作用[4]，对肝癌有良好的治疗作用[5]，但对于胃癌的治疗抑制作用则少有报导，本文以胃癌细胞HGC-27为研究对象探讨索拉非尼联合二甲双胍后对胃癌细胞的抑制作用，为胃癌的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM培养基、胎牛血清(美国Thermo Fisher Scientific公司)，二甲基亚砜、噻唑蓝、结晶紫、p-ERK1/2(WLP1512)抗体、ERK1/2(WL01864)抗体，Bax(WL01637)抗体，Bcl-2(WL03790)抗体(万类生物科技有限公司)，辣根过氧化物酶标记二抗(Santa Cruz公司)，二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司)，倒置显微镜(德国LEICA)，超净工作台(美国Thermo Fisher Scientific公司)，酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，电泳仪及转膜仪(美国Bio-Rad公司)，流式细胞仪(BD公司)青霉素-链霉素溶液(100×)，ECL化学发光显色液(北京索莱宝科技有限公司)，胃癌HGC-27细胞购自上海细胞库。索拉非尼(纯度98.5%)购自湖北兴银河化工有限公司，二甲双胍(纯度99%)购自菏泽巨和实业有限公司，凋亡试剂盒(WLA001a)购自万类生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组情况

对照组为不加药物组，同时加入0.01% DMSO消除差异因素；索拉非尼单药组药物浓度为0、2、5、10 μmol/L，二甲双胍单药组药物浓度为0、2、5、10 mmol/L，索拉非尼在5 μmol/L，二甲双胍在10 mmol/L细胞活力差异开始出现统计学意义。因此后续实验索拉非尼联合二甲双胍药物浓度设置为5 μmol/L(索拉非尼)，10 mmol/L(二甲双胍)。

1.2.2 细胞培养

细胞以含10%胎牛血清和1%的青链霉素的DMEM培养液，在37 ℃，5% CO2饱和湿度条件下进行培养。0.25% EDTA胰酶消化传代，待细胞处于对数生长期时进行实验。

1.2.3 细胞增殖检测

将对数生长期的HGC-27细胞接种于96孔板，培养过夜，待细胞贴壁后，按照上述实验分组给药接着培养48 h。药物作用结束后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，继续培养4 h，随后以150 μL DMSO充分溶解甲臜后，在570 nm波长下测定每孔吸光度值。

1.2.4 细胞集落形成实验

将HGC-27细胞接种于6孔培养板中，每孔1000个细胞，培养过夜后，按照上述实验分组给药继续培养7～10 d，以形成集落肉眼较为明显为依据，观察细胞集落大小终止实验，随后弃去培养液并用PBS轻洗3遍，4%多聚甲醛固定后用结晶紫染色并拍照。

1.2.5 细胞凋亡实验

将HGC-27细胞接种于6孔板中，按照实验分组给药，培养24 h后，用胰蛋白酶悬浮细胞，收集并用PBS洗涤，取105个细胞用binding buffer重悬，加入凋亡试剂盒中PI及Annexin V-FITC避光孵育10 min，1 h内用流式细胞仪检测。

1.2.6 蛋白提取和免疫印迹

取对数期生长的细胞按照上述实验分组给药，药物作用48 h收集细胞，加入含0.1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白。蛋白经12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。以新鲜配置5% BSA室温下封闭1 h，TBST洗膜后，加入用TBST稀释的一抗4 ℃孵育过夜。用TBST充分洗去非特异结合的抗体后，室温下用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h。TBST充分洗涤后，ECL显色后经凝胶成像仪成像分析。根据实验设置，分别用ERK、p-ERK、Bax、Bcl-2、GAPDH作为一抗进行孵育，检测各个指标。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 索拉非尼，二甲双胍及联合用药对HGC-27细胞活力的影响

MTT结果显示，不同浓度索拉非尼(0、2、5、10 μmol/L)及二甲双胍(0、2、5、10 mmol/L)随着剂量增加，均可对胃癌HGC-27细胞起到一定的抑制作用，其抑制作用呈剂量依赖性，索拉非尼在5 μmol/L，二甲双胍在10 mmol/L细胞活力差异开始出现统计学意义，结果见图1。因此选取该浓度进行后续实验，其中索拉菲尼IC50=8.299 μmol/L，二甲双胍IC50=18.973 mmol/L。

a:与对照组相比P<0.05

索拉非尼，二甲双胍及索拉非尼联合二甲双胍处理细胞48 h后，细胞活力在单药作用下有所降低，联合用药细胞活力得到更显著抑制，见图2。细胞的抑制率按如下公式计算：抑制率 = 1-(加药组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。利用金氏公式判断两药的联合效应：Q = E(A+B)/ [EA+(1-EA)×EB]，其中，E(A+B)为两药合用的抑制率，EA、EB为两药单独应用的抑制率，Q在0.85～1.15之间代表两药具有相加效应；Q >1.15代表两药具有协同效应；Q <0.85代表两药具有拮抗作用[6]。二甲双胍联合索拉非尼对HGC-27细胞的抑制率显著高于单药组并且Q = E(A+B) / [EA+(1-EA)×EB] = 0.67 / [0.19+(1-0.19)×0.44] = 1.23，两药具有协同增效的作用，见表1。

表1 单药及二甲双胍联合索拉非尼对HGC-27细胞的抑制作用

a:与对照组相比P<0.05；ab:与met组和sor组相比，P均<0.05

2.2 索拉非尼，二甲双胍及联合用药对HGC-27细胞集落形成的影响

集落形成实验显示，10 mmol/L二甲双胍及5 μmol/L索拉非尼均能起到抑制HGC-27细胞集落生长的作用，联合用药集落基本不再形成，见图3。

2.3 索拉非尼，二甲双胍及联合用药对HGC-27细胞形态的影响

不加药物时细胞生长状态良好，增殖旺盛，细胞圆润明亮，细胞膜轮廓明显，单药索拉非尼或单药二甲双胍作用下细胞生长受到一定程度的抑制，生长较慢，联合用药后细胞生长受到明显抑制，细胞呈现碎片状，见图4。

a:与对照组相比P<0.05；ab:与met组和sor组相比，P均<0.05

图4 索拉菲尼，二甲双胍及联合用药对HGC-27细胞形态影响

2.4 索拉非尼，二甲双胍及联合用药对HGC-27细胞凋亡的影响

对照组细胞的早期凋亡率为2.93%，晚期凋亡率为3.05%，二甲双胍治疗组早期凋亡率为6.68%，晚期凋亡率为7.58%，索拉非尼治疗组早期凋亡率为10.3%，晚期凋亡率为6.1%，联合用药组早期凋亡率为14.4%，晚期凋亡率为6.35%，见图5。

图5 索拉菲尼，二甲双胍及联合用药对HGC-27细胞凋亡的影响

2.5 Western blot 检测ERK、p-ERK、Bax、Bcl-2蛋白表达水平

与对照组相比，索拉非尼单药组，二甲双胍单药组，联合用药均能降低p-ERK的表达，联合用药可以降低ERK的表达，索拉非尼单药和联合用药可以升高Bax表达，3组均能降低Bcl-2的表达，对以上蛋白的调控，联合用药表现出更强的作用，见图6。

a:与对照组相比P<0.05；ab:与met组和sor组相比，P均<0.05；ac:与sor组相比P<0.05

3 讨 论

二甲双胍是一种具有吸引力的抗癌药物，因为其具有良好的安全记录和显著药效，而且二甲双胍作为一种仿制药成本低廉。在过去的10年中，对二甲双胍抗肿瘤活性的研究热度逐年上升，流行病学、临床和实验数据相结合，支持二甲双胍的潜在抗癌作用，本实验中10 mmol/L的二甲双胍已经显现抗肿瘤活性但是效果并不显著。索拉非尼是一种口服多激酶抑制剂，可抑制肿瘤细胞增殖和血管生成，促进肿瘤细胞凋亡。它于2006年被FDA批准用于治疗晚期肾细胞癌，并于2007年作为晚期肝细胞癌(HCC)的独特靶向药物，还可治疗甲状腺癌等多种癌症[7]，虽然索拉非尼可显著延长患者的生存时间，但它有严重的不良副作用包括胃肠道不良反应、高血压、厌食、脱发等[8]并且经常发生耐药性，因此，探索索拉非尼耐药机制并制定个体化治疗策略以应对这些问题具有重要意义，联合用药可以有效减小剂量和毒副作用不失为一种新的治疗策略。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联是参与正常细胞增殖，存活和分化调节的关键信号传导途径，人类三分之一的肿瘤涉及MAPK/ERK信号传导失调，这也成为开发抗癌药物有吸引力的靶标。ERK1/2可能是克服RAF-MEK-ERK途径中获得性耐药的最佳靶点，因此可以看出其在肿瘤治疗中的重要地位。很多肿瘤进程与ERK通路活化相关[9]，也有报道某些药物通过ERK的活化增强药物敏感性[10]，或是通过抑制ERK信号通路的表达发挥抗肿瘤活性[11]。

Bax蛋白可促使细胞发生凋亡，但这种作用机制不是自身直接发挥作用，Bax蛋白的过表达会启动凋亡信号通路，Bax调节凋亡的主要机制是Bax蛋白对Bcl-2蛋白有抑制作用，Bax蛋白是Bcl-2蛋白抑制因子中重要的一个，当Bax蛋白的占优势时，可诱导细胞凋亡，当Bcl-2蛋白占优势时，就会抑制细胞的凋亡，Bax抑制Bcl-2的功能主要通过它的BH1区和BH2区以及与它对应的Bcl-2蛋白形成异二聚体。因此，Bax和Bcl-2表达水平之间的平衡对细胞存活和死亡都很重要。

本研究通过MTT、集落形成实验和细胞形态学3方面的实验结果确定了索拉非尼、二甲双胍及联合用药对HGC-27细胞的抑制作用，其效果并不是1加1等于2而是大于2，但是其作用机制尚不明确，为进一步了解其作用的分子机制，我们用应用western blot分别检查了索拉非尼、二甲双胍及联合用药作用后ERK、p-ERK、Bax、Bcl-2蛋白表达水平，我们发现，与对照组相比，索拉非尼单药组、二甲双胍单药组，联合用药均能降低p-ERK的表达，索拉非尼单药和联合用药可以降低ERK的表达，索拉非尼单药和联合用药可以升高Bax表达，3组均能降低Bcl-2的表达，对以上蛋白的调控，联合用药表现出更强的作用，由此我们可以看出3种治疗方案均能升高Bax/Bcl-2比例，联合用药升高比例更高，通过调控凋亡蛋白表达诱导肿瘤细胞凋亡。3种治疗方案还可以降低p-ERK表达，通过抑制ERK活化抑制肿瘤细胞增殖，同时联合用药在较小用量情况下起到显著抑制胃癌HGC-27细胞增殖的作用，减少了大剂量化疗药物的副作用。以上研究我们可以看出索拉非尼联合二甲双胍在索拉非尼的使用剂量不大的情况下，显著抑制胃癌细胞增殖，为胃癌的治疗及二甲双胍的临床应用提供新思路。本研究基于ERK信号通路及凋亡相关蛋白表达研究索拉非尼联合二甲双胍对胃癌HGC-27细胞的抑制作用，但其对ERK的上游分子和底物的具体作用有待进一步验证。