HBsAg抑制聚乙二醇化α干扰素治疗敏感性的初步分子机制

陈苏华，程振波，李直懋，张国灿，张 冉

（湖南师范大学医学院，长沙 410006）

乙型肝炎病毒（HBV）感染是急、慢性肝炎的主要原因［1］。目前用于治疗乙型肝炎的药物有聚乙二醇化α干扰素（Peg-IFNα）与核苷类似物。但是，Peg-IFNα往往只在治疗初期有效［2］，Peg-IFNα耐药的分子机制尚不清楚。蛋白磷酸酶2Ac（PP2Ac）可以与细胞中的蛋白质精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）发生相互作用，从而导致信号转导子和转录激活子1（STAT1）的低甲基化，抑制Peg-IFNα诱导的信号传导［3-6］。有研究表明，HBV的表面蛋白和X蛋白可以诱导PP2Ac的表达［5］。

本研究分别采用HBsAg特异性免疫球蛋白G（HBIG）和RNAi技术控制细胞内HBsAg的水平，对HBsAg导致干扰素治疗无效的机制进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞培养使用DMEM培养基（GIBCO）加10 %的胎牛血清（GIBCO）将HepG2.2.155细胞（上海细胞生物学研究所，HBV阳性并能完整复制）置于37 ℃、5%的CO2的条件下培养。以3×105/mL细胞密度接种六孔板。24 h后用Peg-IFNα和HBIG分别处理细胞，72 h后收集培养上清进行分析。

1.2 RNAi转染前一天，将HepG2.2.15细胞以2×104个/cm2的密度接种在6孔板中，第二天细胞融合度约50%。对照组仅用siRNA缓冲液处理。按照试剂盒操作说明，使用无血清、无抗生素培养基将10μL Lip2000（Invitrogen）和 150 pmol siRNA 混合进行转染。转染6h后，把培养基换成含10% FBS的DMEM。siRNA处理72 h后，收集上清液和细胞进行进一步分析。

抑制率= ［1-A值（实验组）/ A值（阴性对照）］×100%。

1.3 免疫印迹分析（Western blot）使用冷藏后的PBS和0.1% EDTA收集细胞，PBS洗涤3次，再加入100μL pH 8.0的裂解缓冲液（1%NP-40，80 mM Tris，150 mM NaCl，10mM EDTA），充分混匀后 4℃放置 30 min。1200 g离心5 min去除细胞核。以总上样量为10μg的蛋白在12%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，并转移到0.45μm 的醋酸纤维薄膜，转膜缓冲液为 25 mM Tris /HCl（pH 8.3），192 mM甘氨酸和20%甲醇。使用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h。随后加入一抗和HRP标记的二抗进行检测。一抗分别是抗HBsAg的小鼠单克隆抗体（abcam）、抗PP2Ac、抗PRMT1、抗pSTAT1和抗β-actin（内参）的兔单克隆抗体，1∶1000稀释。二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG单克隆抗体，1：5000稀释。选择β-actin作为内参蛋白，在QUANTITY ONE成像系统（Bio-Rad）下显影。

1.4 ELISA根据雅培HBsAg ELISA试剂盒的说明书，检测HepG2.2.15细胞上清液中分泌的HBsAg量。结果以吸光度值与cut-off值的比值表示，并计算出HBsAg分泌的百分比。

1.5 RNA提取和定量实时PCR（Q-PCR）严格按照Trizol试剂盒（Invitrogen）操作说明书，提取细胞总RNA。使用反转录试剂盒（Takara）以起始模板量为0.5μg的RNA制备cDNA。实时荧光定量PCR使用 SYBR Premix ExTaqⅡ试剂盒（Takara）。扩增仪器为 Step One Plus（Applied Biosystems），扩增程序为 95℃30 s后接着 95℃ 5 s，60℃ 34 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s进行40个循环，做熔解曲线分析。HBsAg基因表达分析的引物 ：上游引物 5'-CTC ACA ATA CCG CAG AGTC-3'和下游引物5'-TAA ACT GAG CCA GGA GAAA-3'。PP2Ac的引物是 ：上游引物 5'-CAA TGG CCT CAC GTT GGT-3'和下游引物 5'-TCC ATG ATT GCA GCT TGG TT-3'。以 GAPDH RNA 作为内对照。GAPDH的引物是：上游引物5'-TGACTTCAACAGCGA CACCCA-3'和下游引物5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCA AA-3'。结果以2-ΔCt表示 mRNA的相对表达水平［7］，实验组和对照组之间的mRNA浓度差异以倍数表示，使用Prism 5软件作图。

2 结果

2.1 HBIG对细胞内HBsAg含量的影响为了分析HBIG对HBsAg分泌的影响，用不同浓度（1.0、0.5和0.25 mg/mL）的HBIG培养HepG2.2.15细胞，以没有添加HBIG的细胞作为对照。培养72 h后，用免疫印迹检测细胞内HBsAg。我们发现用HBIG处理的细胞中HBsAg的表达都有不同程度增加；与对照组相比，用0.25、0.5、1.0 mg/mL HBIG培养的细胞中 HBsAg的分别增加2.24、3.22、5.20倍（图1A）。为了进一步确定PP2Ac是否会随HBsAg的变化而改变，我们还测定了PP2Ac表达量。在相同的细胞质提取物中，我们通过免疫印迹发现，PP2Ac的表达量在使用0.25、0.5和1.0 mg/mL HBIG时，相比对照组分别增加2.13、2.20和3.22倍（图1A）。然后，我们使用实时定量PCR分析了PP2Ac 的mRNA表达量。如图1B所示，所有实验组的PP2Ac mRNA都出现了不同程度的增加。由此表明，当HBsAg水平升高时，PP2Ac出现表达增加。

图1 用不同浓度的HBIG处理HepG2.2.15细胞72 h后 ：（A）Western blot检测HepG2.2.15细胞中HBsAg和PP2Ac表达。（B）qRT-PCR检测HepG2.2.15细胞中PP2Ac的mRNA水平。

2.2 HBsAg诱导PP2Ac表达为研究HBsAg是否影响Peg-IFNα作用通路，我们比较了不同剂量Peg-IFNα组PP2Ac表达水平（图2A）。如图所示，在用Peg-IFNα处理细胞后，PP2Ac的表达被抑制；且在Peg-IFNα浓度为5000 IU/mL时，PP2Ac的表达量最低，可用于后续实验。

然后，我们将细胞在不同浓度HBIG（1、0.5、0.25 mg/mL）培养 72 h，再加入Peg-IFNα（5000 IU/mL）中培养6 h。通过免疫印迹和实时定量PCR分析了PP2Ac的mRNA以及蛋白的表达水平，以确定在Peg-IFNα存在的情况下，HBsAg是否会干扰PP2Ac的表达。结果显示，在不同浓度 HBIG（1、0.5、0.25 mg/mL）HBIG 处理的细胞中，PP2Ac的蛋白表达量时分别为对照组的3.02、2.93、1.34倍（图2B）；mRNA的水平也高于对照组（图2C）。同时，我们还采用免疫印迹分析PRMT1的表达。与对照细胞相比，我们发现在具有高浓度的PP2Ac细胞中，PRMT1明显被抑制（图2B）。

结果表明，HBsAg在Peg-IFNα的存在下增加PP2Ac的表达，并抑制PRMT1在细胞中的表达。

图2 （A）不同浓度的IFN-α处理HepG2.2.15细胞6 h后，Western blot分析PP2Ac的表达。（B）用5000 IU/ml的IFN-α刺激细胞6 h后，以不同浓度HBIG处理HepG2.2.15细胞72 h，Western blot检测PP2Ac和PRMT1的表达水平。（C）处理方法同（B），qRT-PCR检测细胞中PP2Ac的mRNA水平。

2.3 RNAi下调HBsAg的水平我们用三种不同的siRNA（表1）转染HepG2.2.15细胞，并使用一种沉默siRNA作为阴性对照。在用siRNA处理后，分别在24 h、48 h和72 h 收集上清液。经 ELISA（图 3A）、Western blot（图3B）检测发现，在siRNA转染的细胞中HBsAg表达水平被显著抑制。与沉默 siRNA转染细胞相比，三种siRNA对HBsAg的抑制率分别为60.2%、27.8%和57.0%。说明三种siRNA均可有效地降低了HBsAg基因的表达。另外我们同时分析了用siRNA处理72 h后细胞中PP2Ac的表达水平，发现PP2Ac表达水平也显著降低（图3B）。与沉默siRNA转染的细胞相比，三种siRNA对PP2Ac的抑制率分别为44.1%、29.3%和37.0%。实时定量PCR结果（图3C）也表明，随着HBsAg mRNA表达的降低，PP2Ac mRNA的水平随之降低。

表1 RNAi中使用的引物

图3 （A）用三种不同的siRNA或沉默siRNA转染HepG2.2.15细胞。在每个周期结束时，即在三个时间点，通过酶联免疫吸附测定法测试上清液。（B）Western blot分析检测siRNA转染72 h后细胞中HBsAg和PP2Ac蛋白表达水平。（C）转染的72 h后qRT-PCR检测细胞中HBsAg和PP2Ac的mRNA水平。

3 讨论

PP2A是几乎在所有细胞中都表达的一种异源三聚体丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，由36 kD催化C亚基（PP2Ac）、65 kD结构性A亚基和可变调控B亚基组成。PP2Ac在细胞周期调节、形态、发育、应激反应、凋亡和多种信号通路的调节等细胞进程中发挥着效应［8］。PP2Ac在HCV转基因小鼠和丙型肝炎患者的肝细胞都有过表达［4］。另外有研究证明HBV的表面蛋白和X蛋白可以诱导PP2Ac的表达［5］。

近年，有相关研究对病毒逃逸干扰素作用的分子机制做了探讨，PP2Ac会通过Jak-STAT途径影响Peg-IFNα的敏感性［3］。这些研究表明，PP2Ac与PRMT1在细胞中发生相互作用导致STAT1低甲基化和Peg-IFNα诱导的信号传导受到抑制，从而导致HBV患者干扰素治疗无效［4-6］。

体外实验表明，HBIG可以被内吞入肝细胞系，与HBsAg发生相互作用，抑制细胞分泌HBsAg和HBV病毒颗粒［9，10］。RNAi是 siRNA 引起 mRNA 特异性降解的过程。利用RNAi技术可以显著且特异性地抑制HBsAg基因的表达［11，12］。因此，我们使用 HBIG 和基因沉默来调节体外HBsAg的水平。

在本研究中，我们使用稳定表达HBV基因组的HepG2.2.15细胞来分析HBsAg对PP2Ac的作用。结果显示，无论Peg-IFNα是否存在，随着HBsAg的水平升高，PP2Ac的表达均会增加（图1和图2）。表明HBsAg增加可以促进PP2Ac的表达，且Peg-IFNα不能影响HBsAg对PP2Ac的作用。随后我们发现PP2Ac表达增加可以抑制PRMT1的表达（图2B）。PRMT1是在所有细胞中表达的重要酶，并参与许多蛋白质的精氨酸甲基化。PRMT1通过改变STAT1的精氨酸甲基化程度，调节Peg-IFNα诱导的靶基因转录［13］。当HBsAg的表达被RNAi抑制时，PP2Ac基因的表达也被抑制（图3）。我们的结果表明HBsAg可以增强PP2Ac的表达，而PP2Ac可以直接与PRMT1相互作用，进而抑制Peg-IFNα的敏感性。

在HBV的患者血清中，除了感染性颗粒外，还有大量游离的HBsAg以SVP的形式存在［14］。SVP可能会中和宿主产生的抗体，从而增加病毒感染性［15，16］；SVP也有助于产生免疫耐受状态，导致病毒的持续感染［17］。因血清中HBsAg的含量与细胞内HBsAg成正比［18］。血清中存在高浓度的HBsAg预示着患者对干扰素治疗的敏感性低。与以前研究相比，本研究让我们对HBsAg功能有了新的认识，然而，HBsAg与IFN相互作用的潜在分子机制需要进一步研究。

总之，我们使用Western blot，qRT-PCR和ELISA确定了HBsAg对PP2Ac表达的影响；探究了HBsAg抑制干扰素作用的初步分子机制：PP2Ac的上调会抑制PRMT1的活性，最后影响干扰素治疗的敏感性。HBsAg可以影响Peg-IFNα的敏感性，可作为治疗慢性乙型肝炎患者潜在靶标，为慢性乙肝感染患者的治疗方法提供新思路。