高效液相色谱法同时测定利肝隆片中5 种成分含量

吕情花，李永华

（湖南省娄底市食品药品检验检测所，湖南 娄底 417000）

利肝隆片由板蓝根、茵陈、郁金、五味子、甘草、当归、黄芪、刺五加浸膏等中药组方，具有疏肝解郁、清热解毒等功效，用于治疗急、慢性肝炎，迁移性肝炎，慢性活动性肝炎，且对血清丙氨酸氨基转移酶、麝香草酚浊度、黄疸指标降低作用显著，对乙型肝炎表面抗原转阴有较好效果［1］。原标准中仅有化学鉴别项，无含量测定方法。目前，关于该品种的标准研究也较少，但方中单味药主要成分［如板蓝根中的（R，S）-告依春［2-4］，茵陈中的绿原酸［5-7］，五味子中的五味子醇甲［8-10］，刺五加浸膏中的紫丁香苷［11］，甘草中的甘草酸铵［12-13］］的研究报道很多。本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定（R，S）-告依春、绿原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸铵的含量，建立了质量控制标准，可为全面地控制该制剂的质量提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪，包括二极管阵列检测器（美国Waters 公司）；XS205 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为十万分之一）；TP-1200 型电子天平（湘仪天平仪器设备有限公司，精度为千分之一）；KQ5200DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为350 W，频率为35 kHz）。

1.2 试药

（R，S）-告依春对照品（批号为111753-201706），绿原酸对照品（批号为110753-201817，含量为96.8%），五味子醇甲对照品（批号为110857-201714，含量为99.9%），紫丁香苷对照品（批号为111574-201605，含量为95.2% ），甘草酸铵对照品（批号为110731-201720，含量为97.7%），均购自中国食品药品检定研究院；水为Ⅰ级纯化水；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯；利肝隆片（承德天原药业股份有限公司，批号分别为1703007，1712001；黑龙江未名天人制药有限公司，批号为20181107；陕西制药有限责任公司，批号为20170505）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Symmetry® C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脱，0～10min 时10%A，10～40min 时10%A→55%A，40～41min时55%A→10%A，41～50min 时10%A；流速：1.0mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：250 nm。

2.2 溶液制备

分别取（ R，S）告依春、绿原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1 mL 含相应对照品106.2，388.4，224.4，164.9，202.7 μg 的溶液，即得各对照品贮备液；分别精密量取各对照品贮备液适量，置同一容量瓶中，加70%甲醇稀释 成 每1 mL 含 相 应 对 照 品21.24，77.68，44.88，19.79，40.53 μg 的混合对照品溶液。取样品20 片，除去包衣，研细，取细粉1 g，精密称定，置锥形瓶中，加70%甲醇25.00 mL，称定质量，超声（功率为350 W，频率为35 kHz）提取30 min，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按利肝隆片处方和制法分别制备缺板蓝根、茵陈、五味子、刺五加浸膏、甘草的阴性样品，并各取适量，按供试品溶液制备方法分别制备相应的阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，按拟订色谱条件进样测定。结果，各检测成分与相邻成分能完全分离，阴性对照无干扰，理论板数均大于5 000。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密吸取混合对照品溶液1，5，10，15，20 μL，按拟订色谱条件进样测定，以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得各被测成分回归方程和线性范围。详见表1。

表1 5 种成分的线性关系考察结果（ n=5）

精密度试验：取混合对照品溶液适量，连续进样7 次，每次10 μL。结果（R，S）-告依春、绿原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸铵峰面积的RSD 分别为0.27%，0.48%，0.29%，0.35%，0.11%（n=7），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为1703007）样品6 份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果（R，S）-告依春、绿原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸铵的平均含量分别为170.2，797.7，292.8，169.2，405.6 μg/g，RSD 分 别 为0.55% ，0.73% ，0.62%，0.98%，1.14%（n=6），表明方法重复性好。

稳定性试验：取同一批（批号为1703007）样品，依法制备供试品溶液，分别于0，6，12，18，24 h 时各进样10 μL，按拟订色谱条件进样测定。结果（R，S）-告依春、绿原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸铵峰面积的RSD 分别为0.87%，0.68%，1.35%，0.91%，1.01%（n=5），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为1703007），精密加入（R，S）-告依春、绿原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸铵对照品适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

取4 批样品，依法平行制备2 份供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定（R，S）-告依春、绿原酸、五味子醇甲、紫丁香苷、甘草酸铵的含量。结果见表3。

表3 4 批样品含量测定结果（μg/g，n=2）

3 讨论

3.1 流动相选择

曾比较甲醇-0.02%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05% 磷酸溶液，结果表明，以乙腈-0.05%磷酸溶液为流动相梯度洗脱时，各色谱峰的分离度、峰形、基线最好。另外，比较了初始比例，乙腈-0.05%磷酸溶液（15 ∶85，V/ V）和乙腈-0.05%磷酸溶液（10 ∶90，V/ V），结果（R，S）-告依春、紫丁香苷色谱峰保留时间基本一致，最终选择乙腈-0.05%磷酸溶液（10 ∶90，V/ V）。

3.2 提取条件选择

曾考察不同提取时间（15，30，40 min）和不同体积分数提取溶剂（50%，60%，70%，80%，100%甲醇）对样品中各成分溶出量的影响，结果五味子醇甲、紫丁香苷、绿原酸超声提取30 min，在不同体积分数提取溶剂中溶出量基本一致，但（R，S）-告依春、甘草酸铵用70%甲醇提取溶出量最大，故选择用70%甲醇超声处理30 min。3.3 检测波长选择

曾采用DAD 检测器在线采集了5 个成分在200～400 nm 波长范围内的吸收光谱图，结果显示，（R，S）-告依春、绿原酸、紫丁香苷、五味子醇甲、甘草酸铵分别在245，327，265，250，250 nm 波长处有最大吸收，通过分析三维图谱，考虑待测成分的最大吸收及其他成分干扰，最终选择250 nm 为检测波长，（R，S）-告依春、绿原酸、紫丁香苷在250 nm 波长处虽无最大吸收，但也较强，可进行有效检测，且该波长下基线平稳。另外还比较了（R，S）-告依春（245 nm）、绿原酸（327 nm）、紫丁香苷（265 nm）各最大吸收波长处与250 nm 波长处的测定值，结果相差不到5%。可见，在250 nm 波长处各成分的干扰小。故选择250 nm 为检测波长。