水黄花质量标准研究*

马 雪，刘春花，王爱民，王永林，李勇军△

（1. 贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心·省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550004； 2. 贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004）

黔产苗药水黄花为大戟科大戟属植物黄苞大戟Euphorbia sikkimensis Boiss. 的新鲜或干燥全株［1］，又名刮金板、水杨柳、五虎下西川，主要分布于广西、贵州、湖北、四川、云南等地［2-3］，有利尿逐水、清热解毒等功效，主治水肿、水臌、疥疮等［4-5］。目前，对水黄花的研究主要围绕其化学成分展开，分离得到的化合物主要有黄酮类、萜类、酚类、甾体、脂肪酸类等［6-11］。现代药理活性方面，主要对化学成分进行了抗人类免疫缺陷病毒（HIV）、抗血管生成活性研究［7-8］。水黄花为贵州省民间常用民族药，但2003 年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中未收载该品种。现有研究主要集中在重金属检测、含量测定及指纹图谱研究方面［12-14］，其质量标准不完善，不能有效地控制该药材的质量和安全性。本研究中通过性状、显微鉴别、薄层色谱法对水黄花进行鉴别，同时还通过常规检查、浸出物测定，以水黄花主要成分之一槲皮苷作为指标成分进行含量测定，以期建立完善的质量标准，为水黄花的深层次开发和利用提供科学依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

50i 型显微镜及DS-Fi2 型显微成像系统（日本尼康公司）；Reprostar 3 型瑞士卡玛薄层色谱成像系统（瑞士CAMAG 公司）；Ultimate 3000 型高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技公司）；岛津Prominence LC-20A 型快速高效液相色谱仪（岛津公司）；EL204 型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，精度为万分之一）；WPMP-Ⅱ-20 型实验室超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）；CQ-250A-ST 型超声波清洗仪（上海跃进医用光学器械厂，功率为250 W，频率为50 kHz）；XT-A500 型多功能粉碎机（浙江省永康市红太阳机电有限公司）；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；KQ-300DE 型超声波清洗器（昆山市仪器有限公司，功率为300 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

槲皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，纯度为90.6%，批号为11538-201606）；原植物及样品均由贵州省食品药品检验所李扬副主任鉴定为正品，药材信息见表1，标本存放于贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室；对照药材（批号为201601）由贵州医科大学药学院中药民族药标本室提供；所有试剂均为分析纯。

表1 水黄花药材信息

2 方法与结果

2.1 性状鉴别

根据鉴定，水黄花主根为圆柱形；棕褐色；茎枝为圆柱形，直顺，弯曲少，表面灰绿色，光滑，易折断，断面不平坦；叶对生，完整叶片狭长呈披针形，长6～10 cm，宽1～2 cm，先端钝圆，基部急狭，全缘光滑，多延主脉缩卷成条状，表面黄绿色。详见图1。气微，味苦。

图1 水黄花药材

2.2 显微鉴别（切片）

根横切面：木栓细胞数列，栓内层为10 余列薄壁细胞，内含淀粉粒；韧皮部较窄；形成层成环；木质部发达，均木化，占根的大部分，导管单个散在，或多数相聚径向排列，射线宽广。详见图2 至图4。

叶横切面：上表皮细胞由1 列长方形细胞构成，外壁突起；下表皮细胞较小，有乳头状或绒毛状突起；栅栏细胞长柱形，1 列；海绵组织细胞类圆形，4～8 列；中脉维管束外韧型，导管放射状排列，中脉上、下表皮处有1 列至数列厚角组织细胞。详见图5。

图2 水黄花根横切面（×100）

图3 薄壁细胞中含淀粉粒（×40）

图4 根木质部导管（×40）

图5 水黄花叶横切面（ ×10）

粉末显微特征：粉末为灰绿色至灰褐色。叶表皮细胞表面呈多角形，外壁乳头状或短绒毛状突起，呈双圆圈状；石细胞椭圆形、长方形和类方形，直径40～150 μm，有的壁厚10～35 μm，孔沟不明显，有的可见纹孔；木栓细胞类长方形或类多角形，内含棕色物；淀粉粒多见，单粒类球形，复粒由2～4 分粒组成，有的聚集成团，脐点多为点状，可见“一”字状，直径10～40 μm；分泌道碎片易见，含黄棕色分泌物。导管为具缘纹孔、梯纹和螺纹，直径10～80 μm；纤维成束或散在，壁厚，可见纹孔。详见图6。

图6 水黄花粉末显微特征图

2.3 薄层色谱鉴别

取样品粉末0.5 g，加乙醇10 mL，超声（功率200 W，频率40 kHz）处理10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL 使其溶解，作为供试品溶液。另取水黄花对照药材0.5 g，同法制备对照药材溶液。照2015 年版《中国药典（四部）》通则0502 薄层色谱法试验，吸取上述溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 板上，以乙酸乙酯-石油醚（60～90 ℃）-甲酸（2 ∶1 ∶0.05，V/ V/ V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点。色谱图见图7。

图7 不同批次水黄花药材薄层色谱图

2.4 水分、总灰分和浸出物测定

水分：照2015 年版《中国药典（四部）》通则0832 水分测定法（第二法 烘干法）测定，取样品粉末（过2 号筛）2 g，精密称定，平铺于干燥恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5 mm，精密称定，开启瓶盖在105 ℃干燥5 h，盖好瓶盖，移至干燥器中，放冷30 min，精密称定，再在上述温度干燥1 h，放冷，称定质量，至连续2 次称得质量的差异不超过5 mg 为止，根据减失的质量，计算供试品的水分（%）。结果4 批水黄花药材水分含量为10.80%～11.10%，详见表2。

总灰分：照2015 年版《中国药典（四部）》通则2302灰分测定法测定，取样品粉末3 g，置炽灼至恒重的坩埚中，称定质量（精度为0.01 g），缓缓炽灼，避免燃烧，至完全炭化时，逐渐升高温度至550 ℃，使完全灰化并至恒重，根据残渣质量，计算供试品中总灰分的含量（%）。结果4 批水黄花药材总灰分含量为5.29%～5.83%，详见表2。

表2 水黄花药材中水分、总灰分、水溶性浸出物含量测定结果（%，n=2）

浸出物含量：水黄花民间习用方法为水煎煮或捣碎，故选择以水为溶剂进行水溶性浸出物研究，以浸出物作为本品质量控制指标之一。取样品粉末（过2 号筛）2 g，精密称定，置100 mL 锥形瓶中，精密加水50 mL，照2015 年版《中国药典（四部）》通则2201 浸出物测定法中水溶性浸出物热浸法测定，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量。结果4 批水黄花药材水溶性浸出物含量为19.20%～20.33%，详见表2。

2.5 槲皮苷含量测定

2.5.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Venusil XBP C18（L）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（20 ∶80，V/ V）；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：258 nm；进样量：10 μL。理论板数以槲皮苷峰计应不低于5 000。在此色谱条件下的色谱图见图8。

图8 高效液相色谱图

2.5.2 溶液制备

取水黄花药材粉末（过3 号筛）约1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率为200 W，频率为40 kHz）1 h，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1 mL 含槲皮苷0.521 9 mg 的溶液，摇匀，即得对照品贮备液。精密量取对照品贮备液适量，配制成质量浓度为0.024 9 mg/mL 的对照品溶液。

2.5.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密量取对照品贮备液适量，置10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为0.005 0，0.024 9，0.049 8，0.074 7，0.089 6 mg/mL的系列对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，以质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。得回归方程Y=515.03 X-0.079 3（r=0.999 9）。结果表明，槲皮苷质量浓度在0.005 0～0.089 6 mg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

耐用性试验：取水黄花药材（批号为201513）粉末1 g，共3 份，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件，分别调整流动相比例［乙腈-0.1%磷酸溶液（19 ∶81，V/ V）、乙腈-0.1%磷酸溶液（20 ∶80，V/ V）和乙腈-0.1%磷酸溶液（21 ∶79，V/ V）］、pH［乙腈-0.05%磷酸溶液（20 ∶80，V/ V）、乙腈-0.1%磷酸溶液（20 ∶80，V/ V）和乙腈-0.15%磷酸溶液（20 ∶80，V/ V）］、流速［0.9，1.0，1.1 mL/min］、色谱柱［（Puls C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Venusil XBP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］、检测波长（256，258，260 nm）、柱温（32，35，38 ℃）、仪器［UlMate 3000 型（双三元）、UlMate3000 型、岛津Prominence LC-20A型］，进行试验，并计算不同条件下供试品溶液中槲皮苷的含量。结果的RSD 低于2.0%（n=9），表明该方法耐用性良好。

重复性试验：分别取水黄花药材（批号为201513）粉末0.5，1.0，1.5 g，各3 份，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，并计算不同质量浓度的供试品溶液中槲皮苷的含量。结果3 个不同质量浓度供试品溶液中槲皮苷的平均含量为0.19%（按干燥品计），RSD=3.02%（n=9），表明方法重复性良好。

中间精密度试验：以不同的试验人员（2 名），在不同时间按上述方法分别取水黄花药材（批号为201513）粉末1 g，各3 份，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，记录峰面积。结果槲皮苷含量的RSD=2.86%（n=6），表明方法的中间精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，1，2，4，8 h 时按拟订色谱条件进样分析，记录峰面积。结果槲皮苷峰面积的RSD 为0.49%（n=5），表明供试品溶液在8 h 内稳定。

加样回收试验：取已知含量的水黄花药材（批号为201513）粉末0.5 g，精密称定，共9 份，分别按称量样品被测定成分的样品含量加入50%，100%，150%，各3 份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，记录峰面积，并计算回收率。结果见表3。

表3 槲皮苷加样回收试验结果（n=9）

2.5.4 样品含量测定

取各批次水黄花药材粉末1 g，各2 份，精密称定，分别依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样分析，计算含量。结果见表4。

表4 水黄花药材含量测定结果（%，n=2）

3 讨论

水黄花药材作为贵州省民族药广泛使用，目前尚无完整质量控制方法。因此，本研究中首次从根横切面、叶横切面及粉末3 方面对水黄花药材进行了显微鉴别，其显微特征明显，为水黄花药材生药学鉴别提供了科学基础；其次，在薄层色谱鉴别研究中考察了不同厂家的薄层色谱板（青岛海洋硅胶G 板、青岛鼎康硅胶G 板和烟台江友硅胶HSG 板）、不同温度（10，25，30 ℃）、不同相对湿度（32%，58%，72%）、稳定性（0，1，2，3 d）对薄层色谱鉴别方法进行耐用性试验。结果显示，在不同条件下，薄层色谱方法均可鉴别水黄花药材，表明该方法可行。含量测定试验中，对供试品溶液的提取方法（超声提取，回流提取，索式提取），提取溶剂（甲醇，75%甲醇，50%甲醇，25%甲醇，水，95%乙醇，75%乙醇，50%乙醇，25%乙醇）及提取时间（0.5，1.0，2.0 h）等进行了考察。结果显示，采用甲醇超声处理1.0 h 为制备供试品溶液的最佳方法。

综上所述，本研究中通过性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱鉴别、常规检查、浸出物及含量测定方法建立了水黄花药材的质量标准，可有效保证水黄花药材的质量，为水黄花药材的广泛使用及开发提供了理论依据。