肝内胆管癌细胞X 染色体耦联锌指蛋白的表达及复方苦参注射液的调控作用

宋昌兴，李 新，马春兰，张常虹，安贵忠

（1. 青海省第五人民医院，青海 西宁 810007； 2. 青海省政务服务监督管理局，青海 西宁 810007）

肝内胆管癌（ICC）是原发性肝癌中的第二高发恶性肿瘤，发病率仅次于肝细胞肝癌的肝脏原发恶性肿瘤，在东南亚地区较常见［1-2］。其确切病因尚不明确，常见诱因有寄生虫侵入、酒精刺激、肝病恶化、胆管炎等［3］。X 染色体耦联锌指蛋白（ZFX）对人体细胞的生长、繁殖、更新可产生作用，能使人远离各种疾病带来的困扰［4］。复方苦参注射液是一种抗癌药物，由纯中药搭配调和制成，方中苦参对肿瘤细胞有抑制作用。本研究中探讨了复方苦参注射液能否通过调控ZFX 的MAPKs 通路来抑制肝内胆管癌细胞的生长。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料[1]

组织蜡块：收集2015 年7 月至2017 年7 月于医院肝胆外科进行手术治疗且病情资料完整的120 例ICC患者的组织蜡块，其中邻近癌旁组织的正常胆管组织80 例，肝内胆管结石标本40 例。纳入研究患者全身无扩散转移且未经任何放射治疗，其中男89 例，女31 例；年龄38～65 岁，平均（43.23±9.5）岁；淋巴转移22 例，无淋巴转移98 例。排除血清癌胚抗原较低患者。所有患者对该研究均知情，自愿无偿参加。

试药：ZFX 蛋白抗体（美国Abgent 公司，批号为A-AI10955）；GAPDH 抗体（批号为3777-100），PARP抗体（批号为3002-100），均购自美国Bio Vision 公司；p-JNK 抗体（武汉益普生物科技有限公司，批号为CY42771）；p-p38 抗体（美国Santa Cruz 公司，批号为SC-7973）；DAB 显色试剂盒（上海如吉生物科技有限公司，批号为SJH1047）；TRIZOL 试剂盒（北京天漠科技开发有限公司，批号为TM180208）；CCK-8 试剂（上海沪震实业有限公司，批号为HZ2771）；Transwell 小室（北京优尼康生物科技有限公司，批号为353090）；慢病毒（上海汉恒生物科技有限公司，批号为TL-738）。

1.2 方法

蛋白质印迹（WB）法检测ZFX 及MAPKs 通路蛋白：将ICC 组织放入新EP 管中，加入裂解液，混匀。待裂解完成后，离心操作30 min。去上清液，放入EP 管中，冰上保存待用。用BCA 试剂盒检测蛋白浓度，相关步骤按说明书进行。完成后与上样缓冲液混合、离心、低温保存。根据实验要求的数量配胶。在冰箱中取出SDS-PAGE，按说明配制需要的质量浓度溶液，配制好后放入电泳液中，4 ℃保存。电泳后，用无水乙醇活化PVDF 膜，活化后放入超纯水中。用转模仪转模，电压为25 V，电流为0.8 mA。配制p-JNK，p-p38，p-ERK 一抗溶液。孵育后洗膜，用TBST 溶液清洗30 min。洗完后孵育二抗，完成后同样用TBST 溶液清洗，方法同上。洗膜后，拍照，显影后分析。

慢病毒shRNA 介导对ZFX 的干扰实验：在6 孔板中接种ICC 细胞，当细胞的密度升至50%时进行慢病毒感染，MOI 值为20（若需加快转染速率，可接入适量ploybrene 试剂）；细胞成对生长后用嘌呤霉素进行筛选；癌组织细胞放入1.5 mL 离心管中，加入buffer 混匀。静置5 min，加入氯仿震荡，离心，用吸附柱提取总RNA，然后放入逆转录仪器中，按说明书设定程序；逆转录操作结束后，取cDNA 进行PCR 扩增ZFX 和β-catin，置-20 ℃冰箱中保存；将实验中的细胞和荧光试剂放在冰上解冻，解冻后加入相应试剂震荡混合，然后放入荧光定量仪中按设定程序进行荧光定量。基因表达水平操作按试剂盒说明书进行，ICC 肿瘤细胞接种在6 孔板中，在低血清环境中培养（培养基12 h 后需进行更换）。培养结束后，采用多聚甲醛固定、结晶紫染色，通过光学显微镜下观察细胞的颜色、大小，拍照后对细胞进行计数。

CCK-8 细胞增殖实验［3］：用0.5%胰酶消化处于对数生长期的细胞5min，离心操作3min，转速为800r/min。每个96 孔板放入大约5 000 个细胞，每孔加入100 μL 培养基，让细胞在培养液中迅速繁殖。当繁殖密度为40%时，更换培养液，在37 ℃及5% CO2中继续培养，到待测时间点时，加入CCK-8 试剂，每空加入约10 μL。培养1 h，测定吸光度值，波长为450 nm。

免疫组化染色法检测ICC 细胞中ZFX 蛋白分布：免疫组化染色采用DAB 显色，操作步骤按试剂盒说明书严格进行。

Transwell 法检测ICC 细胞迁移能力：用培养基稀释实验所需的Matrigel 胶，待浓度下降至原来的1/5 时，用滴管取40 μL 放入Transwell 中，在37 ℃环境下等待约1 h 孵育完成。用干细胞培养液调整浓度后置37 ℃及5%CO2中孵育24 h。计算ICC 细胞的数量和占比。

2 结果

2.1 ZFX 蛋白在ICC 癌组织中的表达

与癌旁组织中的正常肝细胞相比，癌组织中的mRNA含量较高。与癌旁组织中ZFX 蛋白表达水平相比，癌组织中的明显更高。癌旁组织在染色后，出现阳性区域。ICC 组织染色情况显示，75%癌组织存在高表达状态，而癌旁组织中ZFX 蛋白高低表达无明显差异。详见图1。

2.2 抑制ZFX 表达对肝内胆管癌细胞生长能力的影响

shRNA 的导入显著抑制了ZFX 蛋白的表达；正常培养条件下，ZFX 蛋白的干扰不会影响LM3 和RBE 细胞的生长；在无糖环境下，干扰细胞和对照细胞的增殖能力减弱；在低血清浓度和干扰ZFX 细胞的条件下，胆管癌细胞增殖和存活能力受到抑制。详见图2。

2.3 复方苦参注射液对ZFX 的调控作用

采用肿瘤坏死因子α（TNF-α）联合放线菌酮（CHX）刺激对照细胞和干扰ZFX 的胆管癌细胞进行探讨。单用TNF-α 处理细胞，细胞无形态改变；但经TNF-α+CHX 处理3 h 后，细胞形态产生变化，处理6 h后对照细胞凋亡，而ZFX 干扰组细胞凋亡数量很少。聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶（PARP）水平的检测是在经TNF-α+CHX 处理的细胞裂解液中进行。由图3 可见，对照细胞中PARP 比shZFX 蛋白细胞高，且差异显著。检测MAPKs 信号通路中关键蛋白p-JNK，p-p38，p-ERK 的磷酸化。结果显示，p-JNK，p-p38，p-ERK 在干扰细胞中的磷酸化水平高于对照细胞，表明ZFX 蛋白在MAPKs 通路中调节细胞存活能力。其中，感受氧化应激的p38 的活化最明显，表明复方苦参注射液可调控ZFX 在MAPKs 通路中的表达来抑制细胞的存活能力。

图1 ZFX 蛋白在ICC 癌组织中的表达［6］

图2 抑制ZFX 蛋白表达对胆管癌细胞在不同培养环境中生长能力的影响

图3 ZFX 蛋白调节细胞存活可能通过影响MAPKs 信号通路

3 讨论

锌指蛋白基因家族是人类基因家族中不可缺少的一员［5］，主要由X 染色体编码而成。ZFX 属锌指蛋白家族，与ZFT 及ZFA 为同一家族，其在结构上非常相似［6］。ZFX 内部含有多个C2H2结构，使其结构拥有细胞转录激活区、核定位序列和DNA 结合点［7］，具有保守性。ZFX 通过与锌离子结合成“手指”状，使基因在细胞、人类胚胎发育、造血干细胞自我更新中有重要作用［8-9］。ZFX 在参与干细胞自我更新的同时，可将癌细胞变大变多，加速其增殖和转移，促进癌症恶化，导致患者病情恶化，影响预后［10-11］。但通过下调细胞MAPKs通路使ZFX 基因表达受阻，使ICC 细胞无法在体内外增殖［12-14］。

复方苦参注射液可通过促进淋巴细胞的免疫功能来抑制和杀死肿瘤细胞。现代研究发现，苦参碱可通过影响端粒酶作用［15-16］来发挥上述功能，尤其对T 细胞作用极明显［17］。ICC 在早期无明显症状，患者发现并确诊为该病时已错过最佳治疗时期［18-19］。由于淋巴组织细胞转移和扩散速度快，常规治疗和手术对其无决定性作用，因此大部分患者经手术治疗的预后效果不佳［20］。

本研究结果显示，在ICC 癌组织中ZFX 表达水平很高，癌旁组织中也有表达，但明显低于癌组织。干扰ZFX 的细胞在低血清环境下拥有较高的繁殖能力；在低糖环境下，ZFX 蛋白生长状况较差，表明糖是ICC 细胞生长的必备条件。平板克隆实验显示，ZFX 可抑制细胞凋亡，表明ZFX 蛋白对细胞凋亡有调节作用。信号通路MAPKs 研究结果显示，在ZFX 蛋白干扰情况下，p38 在感受氧化应激条件下蛋白活性异常增强，提示干扰ZFX 蛋白细胞在不良环境下更有存活优势。

本研究中，将ICC 细胞置低糖含量、低血浓度的培养环境下，以探讨ZFX 蛋白的功能。虽然实验条件仍有不足，但对下一步的研究有较大参考意义。本研究中探讨了抑制ZFX 的表达对ICC 细胞的影响，但并未研究增加ZFX 后的效果，可在今后的研究中继续观察。

综上所述，ZFX 在ICC 中处于高表达状态，复方苦参注射液通过对ZFX 在MAPKs 信号通路中的控制，可有效抑制ICC 细胞的生长。ZFX 可能是ICC 的潜在新型生物治疗靶点。