HPLC法同时测定8种三七样品中5种皂苷成分的含量

李瑞婷　娄灯吉　姚星宇　向巧　邹玉林　崔秀明　杨晓艳

摘要 [目的]建立同时测定8种不同三七样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd这5种单体皂苷的HPLC方法。[方法]采用Welchrom C18色谱柱（250 mm × 4.6mm，5 μm），乙腈-水梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长203 nm。[结果]三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd线性关系良好（R2>0.999 1），方法重复性及回收率均符合要求。[结论]不同三七样品的皂苷含量具有差异显著性，此法可为三七药材质量优劣的判断提供一定的理论依据。

关键词 三七;皂苷成分;HPLC;含量测定

中图分类号 R 284文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）16-0184-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.052

Simultaneous Determination of Five Saponins in Eight Panax notoginseng Samples by HPLC

LI Rui-ting1，2，LOU Deng-ji3，YAO Xing-yu4 et al （1.Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming，Yunnan 650500; 2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Panax notoginseng，Kunming，Yunnan 650500;3.School of Chemical，Biological and Environmental Sciences，Yuxi Normal University，Yuxi，Yunnan 653100;4.CSPC-NBP Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shijiazhuang，Hebei 052160）

Abstract [Objective]To establish a HPLC method for simultaneous determination of notoginsenoside R1，ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd in eight Panax notoginseng.[Method]Welchrom C18 column （250 mm×4.6 mm，5 μm） was used for gradient elution of acetonitrile with water at a flow rate of 1.0 mL/min，column temperature of 30 °C and detection wavelength of 203 nm.[Result]The linear relationships of notoginsenoside R1，ginsenoside Rg1，Re，Rb1 and Rd were good （R2>0.999 1）.The repeatability and recovery of the method met the requirements.[Conclusion]The 8 Panax notoginseng samples have significant differences in the content of saponins，and this method can provide a theoretical basis for judging the quality of Panax notoginseng.

Key words Panax notoginseng;Ginsenoside; HPLC;Content determination

基金项目 国家重点研发计划（2017YFC1701900）;国家自然科学基金项目（21562029，31960371）;云南省重大科技专项（2017ZF001，2018ZF014）。

作者简介 李瑞婷（1994—），女，辽宁大连人，硕士研究生，研究方向：生物转化。*通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事中药化学成分分離及分析工作。

收稿日期 2019-12-24;修回日期 2020-02-20

三七，原产于云南和广西交接地区的亚热带山地长绿阔叶林中，为林下阴生植物，适宜于冬暖夏凉的气候，喜半阴潮湿的环境[1]，是我国名贵的传统中药材，其根和根茎可入药，味甘、微苦，性温，归肝、胃经，具有化瘀止血、消肿定痛的功效[2] ，用于治疗咯血、吐血、衄血、便血、崩漏、外伤出血、胸腹刺痛、跌扑肿痛等，是复方丹参滴丸、云南白药、片仔癀、复方三七口服液等常见中药制剂的主要成分之一，目前以三七为配方进入《国家基本药物目录》和《国家中药保护品种目录》的制剂达20余种[3]。三七通常于秋季花开前采挖，洗净，干燥，备用。三七根部主要分为主根、根茎、支根及须根。三七主根呈类圆锥形或圆柱形，长1～6 cm，直径1～4 cm，顶端有茎痕，周围有瘤状突起;三七根茎习称“剪口”，位于三七主根及地上茎之间，呈不规则的皱缩块状或条状，表面有数个明显的茎痕及环纹;三七支根又称大根，习称“筋条”，呈圆柱形或圆锥形，长2～6 cm，上端直径约0.8 cm，下端直径约0.3 cm;三七须根是生长在三七支根上的须状根，中部直径小于0.4 cm。

近代研究表明，三七中的皂苷类成分是其主要的药效成分之一，也是衡量三七内在质量优劣的重要标准，其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 5种皂苷是三七的主要成分，约占总皂苷含量的80%[4]。中国药典规定三七主根及根茎为入药部位，皂苷含量较高，而三七大根及须根皂苷含量较少，价格较为便宜，为非药用部位。此外，三七不同部位随着生长年限的增长皂苷含量有一定量的增加，多以三年生主根或根茎入药，而一年生、两年生、大根、筋条等由于活性成分含量较低，被称为是不合适的三七样品[5]。

目前市场上三七粉末饮片品牌众多，规格繁杂，质量良莠不齐，市售三七粉末饮片中符合2015版《中国药典》规定的合格产品，仅约占市场份额的75%[6]。市场上存在的三七不合格药品多是以假乱真、以次充好或者用非药用部位充当药用部位。该试验抽取的8种三七样本包含了不同年份、不同药用部位、不同产地、不同工艺以及病变三七，采用高效液相色谱法，测定样本中5种皂苷的含量，为鉴定样品质量的优劣提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 三七样品。

供试的8种三七样品均于2018年11月在云南省文山壮族苗族自治州采样或购买所得，经昆明理工大学生命科学与技术学院崔秀明研究员鉴定为五加科人参属植物三七（Panax notoginseng （Burkill） F.H.Chen ex C.H.），8种样品全部为干三七，包括大根（三七的筋条又被称为“三七大根”，采收加工后称筋条，是由块根上生长出的较粗的支根，随着三七年限增加而长粗、伸长、增多）、筋条（采收加工前的大根）、高温烘烤过的主根（三年生）、文山一年生主根、两年生主根、三年生主根、霉三七主根（三年生）、根腐病三七主根（三年生）。

1.1.2 药物与试剂。

三七皂苷R1（批号：wkq18061104）、人参皂苷Rg1（批号：wkq18050401）、人参皂苷Re（批号：wkq18121407）、人参皂苷Rb1（批号：wkq19012107）、人参皂苷Rd（批号：wkq18030803），以上5种单体人参皂苷对照品，全部购自四川省维克奇生物科技有限公司;乙腈为色谱纯，其他有机试剂均为分析纯;水为超纯水。

1.1.3 仪器设备。

高效液相色谱仪（美国Agilent 1260 Infinity），包括四元泵（G1311B）、自动进样器（G1329B）、柱温箱（G1316A）、紫外检测器（G1314F）;BL10-250A型超声波清洗机 （上海比朗仪器有限公司）;FW-135型摇摆式中药粉碎机（上海隆拓仪器设备有限公司）;CP114型电子分析天平（上海奥豪斯仪器有限公司）;UPT-I-20T优普系列超纯水器（成都超纯科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备。

分别精密称取三七皂苷R1以及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd标准品6.03、6.99、2.10、5.98、3.01 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，配成质量浓度分别为0.603、0.699、0.210、0.598、0.301 mg/mL的混合对照品贮备液。

1.2.2 供试品溶液的制备。

参照曾宪彩等[7]和武双等[8-9]的方法，称量样品粉末0.3 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，精密加75%甲醇25 mL，密塞后称定质量，超声提取30 min，放置过夜。次日于超声波清洗机上常温下超声提取30 min，放冷，称定重量，用75%甲醇补足减少的重量，摇匀。转移至离心管内用离心机进行离心（转速3 500 r/min，时间20 min），将上清液与样品固体分离，取上清液过0.45 μm有机膜过滤于2.0 mL进样瓶内，即得三七总皂苷供试品溶液。

1.2.3 色谱条件。色谱柱为Welchrom C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为水（A）-乙腈（B）;梯度洗脱（表1）;流速1.0 mL/min;检测波长203 nm;柱温30 ℃;进样量20 μL。利用DAD检测器在190～400 nm波长范围内对对照品进行波长扫描，确定样品测定的最大吸收波长。

1.2.4 方法学考察。

1.2.4.1 系统适应性试验。分别吸取对照品溶液及供试品溶液，在“1.2.3”色谱条件下，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图，考察系统适应性。

1.2.4.2 线性关系考察。每次精密吸取“1.2.1”对照品储备液1 mL，依次稀释2、3、6、12、30、60、100倍制备系列混合对照品溶液，分别进样20 μL注入色谱仪，按“1.2.3”色譜条件进行测定，记录各对照品的峰面积，以对照品浓度（X，mg/mL）为横坐标、色谱峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归。

1.2.4.3 精密度试验。

吸取“1.2.1”混合对照品溶液20 μL，重复进样3次，测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd这5种皂苷成分的峰面积，并计算其RSD。

1.2.4.4 稳定性试验。

取同一样品（文山三年生主根），按照“1.2.2”方法平行制备供试品溶液3份，室温放置，按“1.2.3”色谱条件分别于0、4、8、12、16、24 h进样分析，分别依法测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd这5种皂苷成分的峰面积，并计算其RSD。

1.2.4.5 重复性试验。

取同一样品（文山三年生主根），按照“1.2.2”方法平行制备供试品溶液3份，在“1.2.3”色谱条件下进行分析，测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的峰面积，并计算其RSD。

1.2.4.6 加样回收率考察。

取同一种含量已知的三七样品3份，分别等体积加入与样品中5种皂苷成分含量相当的对照品溶液，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，测出三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量，并计算其加样回收率及RSD。

1.2.5 样品的含量测定。取8种不同的三七样品，按照“1.2.2”方法制备供试品溶液，按照“1.2.3”色谱条件，测得8种三七样品中5种单体皂苷的含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 系统适用性试验。在“1.2.3”色谱检测波长及相应色谱条件下，混合对照品和样品中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的分离度均较好，经计算样品与其他组分峰的分离度>1.5，理论塔板数按三七皂苷R1计算不低于4 000，符合药典测定要求。对照品及样品的高效液相色谱图见图1。

2.1.2 线性关系考察。分别以对照品浓度（X，mg/mL）为横坐标、色谱峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程，结果表明三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd这5种皂苷成分的线性关系均良好（表2）。

2.1.3 精密度试验。按照“1.2.4.3”操作，重复进样3次，得出三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd峰面积的RSD值分别为1.24%、2.42%、1.62%、1.75%、2.08%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验。按照“1.2.4.4”操作，得出三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd这5种皂苷成分峰面积的RSD值分别为0.81%、0.28%、1.12%、2.37%、3.23%，表明这5种皂苷成分在24 h内稳定性良好。

2.1.5 重复性试验。按照“1.2.4.5”操作，得出三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd峰面积的RSD值分别0.60%、1.73%、0.59%、1.26%、0.95%，表明该方法重复性良好。

2.1.6 加样回收试验。按照“1.2.4.6”操作，结果发现（表3），三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的平均回收率均在95%～105%，RSD分别为0.71%、1.09%、2.70%、0.78%、0.07%。

2.2 含量测定 从不同三七样品的皂苷含量（表4）可以看出，生长年限不同的三七所含的皂苷含量是不同的，随着生长年限的增加所含的皂苷含量是依次增加的，其中，三年生三七>二年生三七>一年生三七;此外，即便同样都是三年生三七，不同部位皂苷含量也是不同的，其皂苷含量从高到低依次为主根、大根、筋条;最后，得病的根腐病三七、发霉的三七和高温烘烤的三七与正常样品（三年生三七主根）相比其皂苷含量均会有不同程度的降低。

3 结论与讨论

高效液相色谱法对三七药材及其提取物的含量测定、质量分析，具有快速、分离效能高、结果准确可靠、重现性好等优势，广泛应用于三七药材、提取物及其制剂的研究中，三七中的单体皂苷三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd含量较高，约占三七总皂苷的80%，这5种单体皂苷含量的高低可以在一定程度上反映三七药材质量的优劣[10]。但三七中皂苷类成分的HPLC检测分析，中国药典以三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、Rg1这3种皂苷作为指标性成分进行定量分析[11]，该研究比较了三七皂苷R1以及人参皂苷Rb1、Rg1、Re、Rd这5种单体皂苷的含量，更为全面一些。

由于市场上三七饮片或药品多以粉末的形式出现，品牌众多，规格繁杂，質量良莠不齐，且无法从表面形态判断其质量优劣。为了能更客观地判断不同三七的质量，该试验收集了8种不同的三七样品（三年生的合格样品和其他7种不合格的样品），对其中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量进行了测定。该试验的8种样品中，一年生的三七主根皂苷含量远低于《中国药典》规定的5.0%，且低于其他情况致不合格的三七样本，可见一年生三七药用价值不高，此外，三年生正常三七主根的皂苷含量最高，病变及过度加工的三年生三七主根样品中5种皂苷含量相较于正常三年生三七主根样品中的皂苷含量有所降低，该试验对不同情形下的三七样本进行了5种皂苷含量的测定，并进行了比较，为三七质量的优劣判断提供一定的理论指导。

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