高压氧对缺氧环境中肺癌A549细胞迁移能力的影响及其作用机理

李静静，孙 勇，张素梅

1.安徽公安职业学院公安科学技术系，安徽合肥,230031;2.合肥市公安局刑事科学技术研究所，安徽合肥,230061;3.安徽医科大学生化教研室，安徽合肥,230032

肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，发病率和死亡率增长迅速，对人群健康和生命造成严重威胁[1]。近半个世纪来，肺癌的发病率在世界范围内均呈上升趋势，尤其是在发达国家。肺癌的病死率也呈逐年上升的趋势，在男性中肺癌位居男性癌症死因首位[2]。当传统的手术切除肿瘤、放化疗等方法达不到预期疗效时，越来越多的学者开始积极探索靶向治疗、免疫治疗以及高压氧等其他辅助治疗措施的使用。

研究表明，肿瘤细胞在体内是处于缺氧状态的，实体瘤因其迅速生长而导致实体瘤组织内氧供不足，造成缺氧微环境[3]。实体瘤所处的缺氧微环境会影响肿瘤细胞中一些基因的表达，包括表达和激活新生血管生成因子，如血管内皮生长因子等，进而促进肿瘤新生血管的生成。同时，缺氧环境也会导致肿瘤细胞过度表达和激活众多的促肿瘤生存因子，使肿瘤细胞恶性程度增加，促进肿瘤细胞的迁移和转移能力，并引起肿瘤细胞对化疗和放疗的耐受和抵抗[4]。那么能否通过破坏肿瘤细胞体内的缺氧微环境达到对肿瘤细胞的抑制甚至灭活？高压氧可以增加肿瘤的氧气灌注，从而改变肿瘤的缺氧微环境，这种高压状态下施用的氧气还能够阻碍肿瘤细胞的脱氧核糖核酸合成，引起脱氧核糖核酸损伤并抑制细胞的分裂[5]。

国际上常用二氯化钴(CoCl2)诱导肿瘤细胞缺氧环境。CoCl2抑制脯氨酸羟化酶的羟化作用，阻碍氧信号的传导，同时钴离子能够竞争血红蛋白成分中的亚铁离子，阻碍形成氧合血红蛋白，降低血液携氧能力，从而诱发细胞缺氧的系列症状[6]。此次实验中首先用CoCl2处理肺癌A549细胞，模拟肿瘤细胞缺氧微环境，再用高压氧进行处理。细胞划痕实验观察A549细胞经过处理后迁移能力的变化，同时Western blot检测JNK、p-JNK蛋白表达情况，初步探讨其可能的分子机制，为治疗或缓解肺癌提供一个新的方案或思路。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人肺癌细胞A549为本实验室保存，常规培养于含10%胎牛血清的1640培养基中，培养条件为5%CO2、37℃、饱和湿度。

1.2 细胞分组情况

将A549细胞分为4组：细胞对照组(cell)、CoCl2处理组(CoCl2)、高压氧处理组(HBO)、CoCl2和高压氧处理组(CoCl2+HBO)。

1.3 主要试剂及仪器

二氯化钴(CoCl2)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和二甲亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司；1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Clark Bioscience公司；BCA法蛋白质定量试剂盒购自美国 Pierce公司；抗人β-actin、JNK和p-JNK特异性抗体均购自美国SantaCruz公司，辣根过氧化物酶标记的二抗均购自美国Millipore公司；增强ECL化学发光试剂盒购自美国 Thermo Scientific公司。高压氧舱(山东烟台，GY3600)；倒置显微镜(Leica DMI 3000B);电泳仪(北京六一仪器厂，DYYTC)。

1.4 高压氧处理

将处于对数生长期的细胞进行如下高压氧处理，每天一次，总共两次。高压氧舱每次紫外线消毒15 min，并纯氧洗舱。细胞在无菌条件下平放进行高压吸氧90 min分钟，其中15 min升压，60 min恒压，15 min减压。在此过程中，HBO室的氧气流量为2 L/min。高压氧处理后细胞继续在二氧化碳培养箱中培养。

1.5 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)法检测细胞增殖情况

待培养瓶中的A549细胞长到80%～90%密度时，弃去培养液，用PBS洗3遍，用0.25%胰酶1 mL消化细胞，加入1 mL完全1640培养基终止消化，反复吹打使成为单细胞悬液后，吸取合适体积置于细胞计数板上细胞计数，用含10%胎牛血清的完全1640培养基调整细胞密度为5×107/L，然后将细胞悬液种于96孔细胞培养板中，每孔种植200 μL细胞悬液。待细胞贴壁，次日小心吸尽96孔细胞培养板中的培养液，加入含有不同浓度CoCl2(50、100、200、300 μM)的完全1640培养液，同时设细胞对照组、DMSO对照组，在37 ℃含5% CO2的细胞培养箱中孵育48 h。向每孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL)，将96孔细胞培养板放入细胞培养箱中，37 ℃温育4 h后，小心弃去上清液，控干。向每孔中加入100 μL DMSO，将96孔培养板放于恒温振荡器中37 ℃振荡10 min，以彻底溶解细胞培养板中的结晶物，然后用酶标仪检测每孔的吸光度值(OD值)，设定波长为570 nm。抑制率计算公式为：抑制率%=(对照孔OD570-实验孔OD570)/对照孔OD570× 100%。细胞增殖实验结果为3次独立实验的平均值，实验中每组设6个复孔。根据不同浓度CoCl2对细胞增殖的抑制情况选取合适的CoCl2进行以下实验。

1.6 细胞划痕实验检测肺癌细胞迁移能力

将肺癌A549细胞接种至两块6孔细胞培养板中，待细胞长满后，用无菌枪头在单层细胞底部中央位置划出“十”字划痕，小心吸弃培养基后，用无菌PBS小心洗去死细胞，显微镜下拍照，记为“0 h”。加入新鲜培养基并将两块6孔细胞培养板分别给予不同处理，每块6孔培养板中的细胞都被分为细胞对照组和CoCl2(50 μM)处理组，其中一块6孔板同时给予每天一次HBO处理。继续培养24 h、48 h后分别观察细胞生长情况并在显微镜下拍照记为“24 h”“48 h”。用Quantity One软件分别测量0 h、24 h和48 h的细胞划痕边界之间的距离，0 h的距离减去24 h或48 h的距离即为24 h或48 h的细胞迁移距离。

1.7 Western Blot检测蛋白表达

经上述处理(处理方法同细胞划痕实验)的各组A549细胞，用PBS洗3遍，每瓶加入300 μL RIPA蛋白裂解液，冰上放置30 min后用细胞刮子充分刮下细胞并吸取转移至标1.5 mL EP管中。为使细胞充分裂解，将收取的细胞裂解液放置于-80 ℃冰箱，完全冷冻后取出放于4 ℃融解，如此反复冻融3次后用4 ℃高速冷冻离心机在14 000 r / min转速下离心30 min。吸取离心后的细胞裂解上清液，转移至新的EP管中。用BCA 蛋白定量试剂盒对每组细胞裂解上清液的总蛋白进行定量并计算蛋白浓度，用RIPA蛋白裂解液调整所有蛋白样品的浓度为同一浓度，加入蛋白上样缓冲液并充分混匀，将各管放于沸水中10 min，冷却后每组取等量的蛋白样品上样至12.5%浓度的聚丙烯酰胺进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上并在室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h后，用p-JNK、JNK、β-actin的抗体4 ℃下孵育过夜。用含0.05% Tween-20的TBS洗涤3次以去除非特异结合的抗体，每次洗涤10 min，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h。用TBS充分洗膜后，用ECL发光试剂盒显影获取对应的特异性条带。用Quantity One软件测定各特异性条带的灰度值，以β-actin为内参照，分别计算p-JNK、JNK的相对灰度值。

1.8 统计学处理

用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，p<0.05为差异，有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度的CoCl2对肺癌A549细胞增殖的影响

MTT结果表明，随着CoCl2浓度的增高，抑制率有逐渐上升的趋势。除50 μM组细胞抑制率为24%，其他组别均大于30%(图1)。因此选取50 μM为此后CoCl2的实验浓度。

2.2 高压氧对缺氧肺癌细胞迁移能力的影响

与细胞对照组相比，单独CoCl2处理促进细胞迁移，单独高压氧处理明显抑制细胞迁移，CoCl2缺氧处理后高压氧处理可以逆转CoCl2促进A549细胞迁移的能力(图2)。

图2 不同处理对A549细胞迁移能力的影响与细胞对照组相比*p<0.05，与CoCl2组相比#p<0.05

2.3 CoCl2、高压氧处理对A549细胞内JNK、p-JNK表达的影响

相对于细胞对照组，单独CoCl2处理组p-JNK表达量上升，高压氧单独处理组p-JNK表达量降低。而CoCl2和高压氧共同处理组相较于细胞对照组和单独CoCl2处理组p-JNK表达量也降低,见图3。

图3 不同处理对A549细胞JNK、p-JNK蛋白表达的影响与细胞对照组相比*p<0.05，与CoCl2组相比#p<0.05

3 讨 论

过度无限制的增殖是肿瘤细胞的主要特征之一，肿瘤细胞的快速增殖使肿瘤细胞处于一个持续的相对低氧状态的微环境，而肿瘤细胞为应对这种低氧状态而进行的一系列基因表达和代谢的变化又进一步促进肿瘤细胞的恶性增殖和转移能力[7]。高压氧疗法(HBO)是一种被广泛应用于临床治疗的有效方法，包括一氧化碳中毒、颅脑损伤、软组织严重感染坏死和减压病等疾病。已有众多研究证实，HBO有化疗或者放疗增敏作用，可与化疗或者放疗联合应用于肿瘤治疗，是一种能有效增强其他治疗方法效果的辅助治疗方法[8]。本研究探讨HBO的联合抗肿瘤作用是否与缓解肿瘤细胞缺氧所致的肿瘤恶性程度增加和转移能力增强有关。

通过不同处理组细胞迁移结果看，单独CoCl2诱导缺氧组迁移距离较正常细胞组增加，说明体内缺氧微环境增加了A549细胞的不稳定性，促进其迁移扩散。施加高压氧处理后，细胞迁移距离明显缩短，说明高压氧抑制了缺氧微环境下的肺癌A549细胞的迁移甚至扩散。

高压氧抑制缺氧的肺癌A549细胞迁移是本试验中最直观的结果，用Western blot检测JNK磷酸化水平的变化以进一步探讨高压氧抑制缺氧肺癌A549细胞的迁移的可能分子机制。丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族信号通路在细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要调节作用，其重要成员之一c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminlki-nase，JNK)，可参与调控细胞对内源和外源应激因素的反应，因此也被称为应激激活蛋白激酶。JNK信号通路可被众多刺激物激活，在肿瘤侵袭与转移过程中发挥重要作用[9]。近年来,已在宫颈癌、肝癌、星形细胞瘤、前列腺癌、乳腺等多种肿瘤发现了JNK异常表达[10-14]。在本实验中，CoCl2处理后的A549细胞JNK的磷酸化水平升高，而高压氧则降低JNK的磷酸化水平。

就目前的实验结果可以看出，缺氧微环境下肺癌细胞A549迁移能力增加，进行高压氧处理可以抑制其迁移能力，且缺氧状态下肺癌细胞A549的JNK磷酸化水平增加，高压氧可以降低其JNK的磷酸化水平。但是高压氧逆转缺氧对肺癌细胞A549的作用是否还有其他信号通路的调节，JNK通路具体发挥怎样的作用还有待进一步的研究。