BMP-2修饰掺锶磷酸钙修复去卵巢大鼠股骨干骺端骨缺损实验研究

周茂生，胡旭峰，谢加兵，吴兴净，张 欣

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 创伤骨科，安徽 芜湖 241001)

骨质疏松症是一种以骨密度和骨量减少为特征的疾病，在美国、欧洲和日本危害7500万人，每年全世界超过890万人出现骨质疏松性骨折[1]。一旦发生骨折或缺损时超过一定体积，就需要骨移植手术进行骨修复。自体骨移植是目前广泛接受的治疗骨折和骨缺损最常用方法之一[2]。由于自体骨移植供区有限，同种异体骨移植可能出现排斥反应，因此人工合成材料备受关注[3]。磷酸钙(calcium phosphate,CPC)具有良好的生物相容性、生物降解性和骨传导性，是目前应用最广泛的骨再生材料之一[3-5]。先前的研究表明，CPC中锶(Sr)的存在可促进生物材料的吸收性和随后的骨形成[6]；骨形态发生蛋白2(BMP-2)由于其优异的骨诱导能力而被广泛用于促进骨修复；BMP-2可以通过收集骨祖细胞并诱导成骨分化来促进骨修复[7]。由于临床使用中BMP-2局部剂量较高，会出现一些不良反应，如异位骨化与椎管狭窄导致脊髓压迫等[8]。本研究将BMP-2复合Sr修饰CPC对比研究同等剂量BMP-2复合CPC修复骨质疏松骨缺损治疗效果，验证新复合材料治疗骨质疏松骨缺损的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验动物 50只3月龄雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠纳入本研究，在环境温度(22±1)℃和相对湿度(45±50)%的条件下随意饲养，水和食物可以自由接触。自动控制明暗周期约12 h。所有程序均经我院动物伦理委员会批准。

1.2 材料制备 CPC和Sr/CPC的制备使用等摩尔TTCP[Ca4(PO4)2O]和DCPA(CaHPO4)制备CPC前体粉末。随后按照1 mg粉末加入0.2 mg BMP-2，固化剂为 0.5 mol/L 稀磷酸，在室温、100% 相对湿度条件下分别固化 24 h，制成直径2.5 mm、高度5 mm样品(固化时粉、液质量比为2∶1)。分别为CPC、BMP-2/Sr/CPC(每1 mg材料中含有0.2 mg BMP-2)和BMP-2/CPC(每1 mg材料中含有0.2 mg BMP-2)，具体材料制备步骤参考文献[9]。

1.3 模型建立 双侧去卵巢手术后12周，将大鼠随机分为： 假手术组(Sham，n=5)和卵巢切除模型组(OVX，n=45)。模型建立12周后，OVX大鼠随机分为对照组(Con组) 、CPC组(CPC组)、BMP-2/CPC组(BCPC组)和BMP-2/Sr/CPC组(BSCPC组),随后在大鼠股骨髁制作直径2.5 mm、长5 mm圆形缺损。通过腹膜内注射4 mL/kg水合氯醛麻醉大鼠。在双侧股骨髁外侧进行皮肤切口，并进行股四头肌钝性解剖以暴露股骨干骺端。然后制作一个直径2.5 mm圆形缺损。分别植入通过注入盐水冲洗孔，以从空腔中去除骨碎片，CPC组、BCPC组和BSCPC组分别植入相对应的材料。随后使用缝线逐层缝合筋膜和皮肤。

1.4 样本的收集和检测 各组大鼠在缺损术后8周用过量水合氯醛将大鼠安乐死。收集双侧股骨，清除黏附的软组织，将右股骨用冰浸在盐水中的纱布包裹。

使用乙二胺四乙酸(Sigma-Aldrich，Saint Louis，USA)将股骨样品脱钙8周，将脱钙的骨样品包埋在石蜡中并使用苏木素(Hematoxylin)和伊红(Eosin)染色后用显微镜(Nikon Eclipse 80i，Tokyo，Japan)检查组织切片。

使用微计算机断层扫描(Micro-CT； Y.Cheetah； YXLON International GmbH，德国)评估骨缺损愈合的影响。使用VG Studio 2.1 V软件(版本2.6)对股骨进行扫描，并对18 μm(像素)处的管电压为80 kV且电流为60 μA的X射线进行成像。在180°的角度范围内总共获取了450个投影。使用基于Feldkamp算法(Sky Scan)的锥束重建软件重建图像切片。定义了标准化的三维关注区域，其圆柱形状为3 mm长和2.5 mm直径。获得骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁体积分数(BV/TV)、骨小梁数(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)来自于Micro-CT的3D渲染图像。

左侧股骨缺损区域在冰冷裂解缓冲液中匀浆。蛋白浓度用BCA蛋白分析试剂盒(Thermo Scientific)定量。用SDS-PAGE在812%聚丙烯酰胺凝胶上分离等量的总蛋白，并将其转移到硝化纤维素膜。免疫印迹与一抗包括Notch(Ab15251)和RUNX-2(Ab23981)；CBF 1(Ab15345)和Jagged 1(Ab15341)。在4℃下孵育过夜，然后与相应的二抗在室温下孵育1 h。用ECL-plus试剂对斑点进行可视化，并用Lab Image Version 2.7.1对结果进行量化。

2 结果

2.1 造模结果 由于麻醉感染OVX组共5只大鼠死亡，去卵巢术后Sham组及OVX各亚组均随机选取5只大鼠。腰椎(L2～L4)的骨密度(bone mineral density，BMD)通过双能X射线吸收法(Lunar Prodigy Advance，GE Lunar，Madison,WI,USA)在麻醉下进行检测。Sham和OVX组的BMD分别为(225.54±28.35)mg/cm2和(162.45±25.33)mg/cm2。在定量分析中，Sham组的骨密度比OVX组高27.97%(t=3.711，P=0.006)；这些结果证实了去卵巢诱导骨质疏松症模型建立成功。

2.2 Micro-CT分析 缺损区域骨小梁的三维重建结果见图1，骨微观参数BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp如表1所示。治疗8周后，CPC组、BCPC组和BSCPC组微结构参数BV/TV、Tb.Th、Tb.N高于Con组，而Tb.Sp低于Con组(P<0.05)；同时发现CPC、BCPC和BSCPC组之间的BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp差异均有统计学意义(P<0.05)，且BSCPC组缺损区域具有最佳的微观参数BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp。

A：Con组；B：CPC组；C：BCPC组；D：BSCPC组。

表1 Micro-CT分析检测BV/TV、Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th指标比较

2.3 组织学分析 术后8周，Con组缺损被薄而疏松的结缔组织填充，CPC、BCPC和BSCPC组新生骨量多于Con组。与Con组相比，BSCPC组和BCPC组缺损部位被较多的新形成骨组织充填，缺损区被修复较多，但是可见较多的生物材料残留。与CPC或BCPC组相比，BSCPC组缺损部位从缺损边缘到中心均可见大量的骨组织形成，可见较多成熟骨组织，只有较少的生物材料残留(图2)。

2.4 蛋白印迹分析 结果显示，与Con组比较，CPC组、BCPC组和BSCPC组Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2蛋白表达上调(P<0.05)；同时发现CPC、BCPC和BSCPC组之间的Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2差异均有统计学意义(P<0.05)，且BSCPC组缺损区域Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2表达上调最为明显。见图3和表2。

A：Con组；B：CPC组；C：BCPC组；D：BSCPC组。红色箭头：新生骨组织；黄色箭头:未吸收材料。

图3 Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2的蛋白表达检测结果

表2 检测Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2的蛋白表达比较

3 讨论

CPC因其抗压强度，出色的生物相容性和骨传导性及可吸收性而在支架材料中脱颖而出。尽管具有上述优点，但缺乏骨诱导性是CPC的关键缺陷之一，这可能导致骨不连，特别是在修复骨质疏松骨缺损方面。作为最具代表性的骨生长因子，BMP-2已获得美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMEA)的批准，用于治疗骨不连或者促进脊柱融合[10]。Sr在元素周期表中与钙元素属于同族元素，Sr能有效抑制破骨细胞，同时促进成骨细胞的活性。因此，Sr元素一直作为骨质疏松研究领域中的“明星”元素；一方面，在成骨细胞富集的细胞中，能增大胶原蛋白与非胶原蛋白的合成，通过增强前成骨细胞的增殖而促进成骨细胞介导的骨形成。另一方面，能剂量依赖地抑制前破骨细胞的分化，从而抑制破骨细胞介导的骨吸收[11]。

在目前的工作中，我们通过将Sr2+和BMP-2引入CPC来增强骨骼组织生长，从而开发出完善的CPC骨骼替代材料。为了开发一系列SCPC，将碳酸锶(SrCO3)颗粒与不同含量(0和5 wt.%)的CPC粉末均匀混合[12]。虽然更高剂量的BMP-2可以取得更好的结果，但是显著增加不良反应的发生率，如逆行射精，抗体形成，神经根炎，术后神经根损伤，异位骨化，血肿形成，伤口愈合并发症和新发肿瘤等风险[13]。在本研究中，我们观察到较低剂量BMP-2复合Sr修饰CPCP可以改善BMP-2复合CPCP修复骨缺损效果。与CPC和BCPC组相比，BSCPC治疗骨缺损时，骨组织形成迅速，Mciro-CT检测结果显示具有较高BV/TV、Tb.N和Tb.Th及较低Tb.Sp，这表明BSCPC修复骨缺损效果更佳。

研究表明Notch 信号通路不仅影响血管内皮细胞和血管形成[14]，而且在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化及成骨过程中作用巨大[15]。因此Notch信号通路对血管内皮细胞影响和血管的生成、以及对成骨细胞功能和在骨修复过程中都有重要的作用。RUNX-2在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化及成骨过程中也起到重要作用。本研究使用蛋白印迹观察Notch信号通路Notch 1、CBF 1和Jagged 1和RUNX-2表达情况，结果发现BSCPC组的RUNX-2、Notch 1、CBF 1和Jagged 1蛋白表达水平高于CPC和BCPC组，表明BMP-2复合Sr修饰CPC材料修复骨质疏松骨缺损可能和Notch信号通路激活和RUNX-2表达上调有关。

这项关于临界骨缺损修复的研究结果表明，将BMP-2修饰掺锶CPC将有望快速实现骨质疏松性骨缺损修复。但具体机制和最佳组合剂量还需要进一步研究。