三氟淫羊藿素通过Notch1抑制大鼠慢性脑缺血损伤后过度自噬

周海倩，张丽梅，葛清莲，蔡宇逸，刘瑞珍，黎 晓，黄志华

（1.赣南医学院2017级硕士研究生；2.赣南医学院2018级硕士研究生；3.赣南医学院2018级本科生；4.赣南医学院基础医学院，江西 赣州 341000）

慢性脑缺血（Chronic cerebral ischemia，CCI）被认为是阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）、血管性痴呆（Vascular dementia，VD）等多种疾病发生发展过程中一个重要环节。由于病程迁延不愈，脑组织往往出现诸如胶质细胞活动变化、炎性反应，以及神经元变性等一系列病理改变［1］，其损伤机制复杂，包括兴奋性毒性、钙超载、氧化应激、细胞凋亡、坏死、自噬（Autophagy）和炎症等。之前的研究表明缺血性脑损伤可促进哺乳动物生发中心的神经元再生［2］，慢性脑缺血时也可在药物干预下通过调节神经生长因子、神经递质、激素等促内源性神经元再生，如雌激素可促进室管膜下层（subventricular zone，SGZ）细胞增殖，参与神经元再生［3-4］。因此，雌激素类药物有望成为神经系统疾病康复治疗的新方向，但长期使用雌激素易诱发妇科肿瘤等明显不良反应。植物雌激素结构与雌激素类似，淫羊藿素（Icaritin，ICT）是植物雌激素的一种，具有多种药理作用，对脑缺血损伤有保护作用［5-6］，对慢性脑缺血的治疗可能也有一定作用。三氟淫羊藿素（trifluoro-icaritin，ICTF）为ICT 的衍生物，作为黄酮类化合物其化学结构与雌激素类似，低剂量时具有弱雌激素，高剂量时具有抗雌激素作用，因此长期使用的不良反应小。

越来越多的证据表明，自噬在慢性脑缺血中起重要作用，调控自噬可能为治疗慢性脑缺血提供新方向［7］。自噬通过自噬溶酶体系统对自身细胞质内异物、损伤和衰老细胞器进行吞噬降解的过程，它属于非胱冬肽酶依赖的程序性死亡，因此它在维护细胞内环境稳态方面起着重要作用，它似乎是神经元稳态、神经元可塑性和蛋白质质量控制所必需的［8-9］。由于自噬过程中活性蛋白质的运输和性质，生理状态下，神经元的存活高度依赖于自噬。但正常机体神经细胞内自噬体、溶酶体数量较少，而处于缺血再灌注状态时，细胞线粒体功能障碍、酸中毒、氧化应激、钙超载、兴奋毒性和炎症反应等均可激活自噬，导致细胞自噬性死亡。研究表明，Notch1信号可以调控自噬，应激条件下Notch1 信号触发自噬需要配体依赖的Notch1 胞内结构域活性，其控制线粒体和活化的调节性T 细胞（Regulatory cells，Tregs）在营养素稀缺的条件下存活，因此Notch1 对自噬的整合和细胞分化有影响［10-11］。激活Notch1信号可能通过降低自噬从而缓解高温高湿所致的心肌缺血损伤［12］。在中枢神经系统，Notch1 信号是否能通过抑制慢性脑缺血诱导的过度自噬，从而促进神经元再生，目前尚不清楚。课题组前期研究发现，ICT及ICTF对慢性脑缺血也有一定的保护作用，本文主要探讨ICTF对自噬过程的标记蛋白LC3-Ⅱ、Notch1表达的调控作用，为进一步研究ICTF 对慢性脑缺血后过度自噬的保护机制寻找新的分子靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性SD 大鼠，体重180～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［动物中心许可证号：SCXK（湘）2016-0002，动物合格证号：43004700003244，级别：SPF级］。

1.2 试剂及药物三氟淫羊藿素（C21H17F3O5）购自上海天习化工有限公司，纯度99%以上，用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，DMSO 购自sigma 公司（货号：D2650），实验前稀释至所需浓度。Notch1 抗体（货号：#4380）和LC3-Ⅱ抗体（货号：2775S）均购自Cell Signaling Technology 公司；β-actin抗体购自invitrogen 公司（货号：MA5-15739）；山羊抗兔IgG（货号：31460）、山羊抗鼠IgG（货号：31430）、PVDF 膜（货号：88518）、蛋白定量试剂（货号：A33972）、增强化学发光试剂（货号：34580）均购自Thermo Fisher公司。

1.3 实验方法

1.3.1 2-VO 模型制备及ICTF 治疗雄性SD 大鼠18 只，体重180～220 g，随机分成3 组，每组6 只：假手术组、脑缺血模型组、ICTF治疗组（0.1 mg·kg-1、0.3 mg·kg-1）。大鼠用10%水合氯醛溶液（350 mg·kg-1，i.p.）麻醉后，参照SARTI等［13］的方法制备双侧颈总动脉永久性结扎模型（bilateral common carotid arteries occlusion，2-VO）。充分暴露并仔细分离结扎一侧颈总动脉，1 周后同样方法再结扎对侧颈总动脉，大鼠苏醒后，将眼睑下垂、眼裂变小者视为2-VO手术成功。假手术组大鼠仅暴露颈总动脉，不结扎颈总动脉。术中严格控制室温在23 ℃～25 ℃。ICTF治疗组按剂量分组每天腹腔注射一次ICTF，注射体积为1 mL·kg-1，连续给药8周，假手术组和模型组腹腔注射同体积的生理盐水。

1.3.2 Morris 水迷宫实验大鼠于给药第8 周行Morris 水迷宫实验观测空间学习记忆能力。（1）适应性训练：实验前让大鼠在无安全平台的水中自由游泳120 s以适应周围环境。（2）定位航行实验：将大鼠面向池壁放入水中，待大鼠找到平台之后，让其在平台上停留30 s，设定最长游泳时限为120 s，记录大鼠找到平台所需要的时间称逃避潜伏期（platform search time）作为检测学习记忆的指标。如果在120 s 内未找到平台，将大鼠牵引至平台，停留30 s，潜伏期记为120 s。大鼠分别从4 个不同的入水点入水，每次训练间隔至少60 s，共训练5 d。定位航行实验通过对训练大鼠游泳寻找平台，观察其逃避潜伏期长短，比较各组的平均潜伏期，以评价大鼠空间学习记忆能力。（3）空间探索实验：定位航行实验后，即实验第6 d，撤除平台，将大鼠从任意入水点放入水中，观察并记录60 s 内其在搜索原平台的游泳轨迹和时间。用于测量大鼠学会寻找平台后，对平台位置的记忆能力。

1.3.3 qPCR 方法检测自噬相关基因的表达水迷宫实验后，同上方法麻醉大鼠，取海马区脑组织20 mg，按试剂盒说明提取总RNA，多功能酶标仪行RNA 定量，严格按试剂盒说明加样，qPCR 仪检测自噬相关蛋白的mRNA表达。

1.3.4 Western blot 方法检测蛋白的表达取海马区脑组织20 mg，加入蛋白裂解液，匀浆后，4 ℃充分裂解1 h，12 000 rpm×5 min，4 ℃离心，BCA 方法行蛋白定量，取50 μg 总蛋白加入Loading buffer 煮沸变性，经SDS/PAGE 凝胶电泳，然后电转移至PVDF 膜，5%牛奶封闭后，分别用Notch1、LC3-Ⅱ及β-actin 一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，增强化学发光试剂孵育1 min 后，Amersham Imager 600系统进行照相及灰度分析。

1.4 统计学方法应用Prism 5.0 软件进行分析。各测量指标的数据资料以mean±SEM 表示，组间各测定指标的总体比较采用单因素方差分析，组内各指标的多重比较采用SNK 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ICTF 对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力的影响Morris 水迷宫实验探测慢性脑缺血大鼠认知功能结果显示，0.3 mg·kg-1ICTF 干预8 周后慢性脑缺血大鼠经过第Ⅲ象限（原平台所处象限）的次数明显多于模型组大鼠，提示ICTF对慢性脑缺血诱导的认知功能障碍有改善作用（图1）。

2.2 ICTF对2-VO大鼠海马组织LC3-Ⅱ和Beclin-1的mRNA 表达水平的影响图2 示，0.1 mg·kg-1及0.3 mg·kg-1ICTF治疗组相对模型组LC3-Ⅱ、Beclin-1、Atg13 mRNA 的表达明显降低，差异有统计学意义。

图1 ICTF对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力的影响

图2 ICTF对慢性脑缺血大鼠海马组织LC3-Ⅱ、Beclin-1和Atg13 mRNA表达的影响

2.3 ICTF 对2-VO 大鼠海马组织LC3-Ⅱ和Notch1 的蛋白表达的影响基于行为学实验结果发现0.3 mg·kg-1ICTF 治疗效果显著，于是我们选取0.3 mg·kg-1ICTF 用于研究相关蛋白的表达。0.3 mg·kg-1ICTF 治疗组与2-VO 模型组比较LC3-Ⅱ和Beclin-1 表达下降，Notch1 表达升高，差异有统计学意义，提示ICTF治疗后降低慢性脑缺血诱导的过度自噬，并且ICTF治疗后会激活Notch1信号（图3、图4）。

图3 ICTF对慢性脑缺血大鼠海马组织LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达的影响

图4 ICTF对慢性脑缺血大鼠海马组织Notch1蛋白表达的影响

3 讨 论

慢性脑缺血是指脑整体水平的慢性持续低血流灌注状态，每100 g 脑组织血流量低于40～60 mL·min-1［14］。慢性脑缺血会导致脑代谢障碍和中枢系统的神经功能损伤，可引起眩晕、记忆力下降或智力减退、定向力障碍等系列症状，不可忽视的是，慢性脑缺血是VD、AD等多种慢性脑血管疾病的共同病理过程［15］。然而目前针对慢性脑缺血后的脑神经功能损伤的修复尚缺乏明确有效的治疗药物。因此，寻找有效的干预药物，对延缓慢性脑血管疾病的进展，尤其是血管性痴呆的进程以及改善慢性脑血管疾病的预后具有重要的临床意义。本研究通过Morris水迷宫实验观察大鼠的空间学习记忆能力，从行为学的角度明确ICTF对慢性脑缺血损伤后大鼠认知功能的作用，我们的结果表明，模型组大鼠在目的象限停留时间明显低于假手术组大鼠，提示慢性脑缺血损伤后大鼠的空间记忆功能受损。而连续给予8 周ICTF 治疗后，大鼠的空间记忆功能明显改善，提示ICTF治疗对慢性脑缺血诱导的认知功能障碍有改善作用。

自NITATORI等［16］于1995年用电镜首次在短暂全脑缺血再灌注后海马CA1 区锥体神经元上观察到自噬现象后，不断有研究表明，自噬与缺血性脑损伤、神经退行性疾病、VD 等多种神经系统疾病有密切关系。自噬在慢性脑缺血中起重要作用，自噬在缺血性脑损伤过程中究竟扮演何种角色仍是个“黑盒”，但是过度的自噬会导致慢性脑血管疾病更为严重。因此有研究认为，下调过度的自噬也许是治疗缺血性脑血管疾病的新方向［17-18］。Beclin1 和LC3-Ⅱ蛋白被认为是自噬形成的标记性蛋白，Beclin1 介导自噬的启动阶段及自噬体的形成，并调节其他自噬蛋白在自噬前体膜的定位［19］；LC3-Ⅱ是一种定位于前体自噬泡和自噬泡膜表面的组织蛋白，参与自噬体的形成［20］，在Atg4 作用下，LC3 前体被加工成为可溶性的LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ在Atg3（E2 样酶）和Atg7（E1 样酶）作用下与磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl-ethanolamine，PE）连接成为脂溶性的LC3-Ⅱ-PE，参与自噬溶酶体膜的延伸，直到自噬溶酶体形成；最终P62 蛋白再与LC3-Ⅱ蛋白结合形成复合物，在溶酶体内降解。研究结果发现，与对照组相比，模型组LC3-Ⅱ蛋白的表达水平明显升高，经三氟淫羊藿素治疗后，LC3-Ⅱ相应表达量显著下降，提示ICTF治疗会抑制慢性脑缺血损伤后过度的自噬，减少脑损伤，促进慢性脑缺血后的神经功能修复。因此，我们推测ICTF对慢性脑缺血的改善作用可能与调节过度自噬有关。

Notch 信号传导通路由Notch 受体、配体和CSL（CBF1-suppressor of hairless-lag-1）蛋白、靶蛋白等组成。Notch 蛋白是一种细胞表面跨膜受体，其胞外段可与配体Delta 等相互作用，在早老蛋白-1（Presenilin-1）/γ-分泌酶作用下Notch向细胞膜内侧释放出胞内段（Notch intracellular domain，NICD），NICD 转移进入细胞核，与CBF1（C-promoter binding factor 1）结合，形成复合物，激活转录因子和Hes 家族［21］。Notch 信号通路对中枢神经系统发育和维持神经干细胞的未分化状态和自我更新发挥重要的调节作用［22-23］。有趣的是，神经元缺血再灌注损伤后，Notch1 表达与神经元再生呈正相关［24］，且Notch1 蛋白在脑缺血术后离体培养形成的神经祖细胞（neural progenitor cells，NPCs）中高表达［25］，激活后能减少脑缺血后神经干细胞（neural stem cell，NSCs）死亡，促进SGZ 区神经元发生［26-27］，提示Notch1 与神经损伤修复相关。Notch1 信号不仅在成熟脑组织中神经干细胞池的稳定中发挥重要作用［21］，并且还调控颗粒细胞层新生神经元的整合［28］，提示Notch1 信号可能促进脑组织神经再生，可作为脑缺血治疗的新靶点。在本研究中我们发现，ICTF 可能通过激活Notch1 信号，促进神经元新生进而改善大鼠认知功能障碍，ICTF 是否通过Notch1信号抑制大鼠慢性脑缺血诱导的过度自噬仍需要进一步研究。

综上所述，ICTF 抑制慢性脑缺血损伤后的过度自噬，从而减轻慢性脑缺血损伤后因过度的自噬反应导致的神经元损伤，改善认知功能障碍，并且ICTF 可能激活Notch1信号通路来促进神经元再生。本项研究为开发慢性脑缺血损伤后脑神经保护及康复治疗的药物提供了实验依据，但ICTF究竟如何影响Notch1 信号通路进而调控慢性脑缺血损伤后的过度自噬有待我们在后续的工作中进一步研究。