根皮乙酰苯-4′-β-新橙皮糖苷合成新橙皮苷工艺研究

刘 坚，王 振，蒋书歌，梁曾恩妮，付复华，肖业成，单 杨*

(1.湖南大学 研究生院隆平分院，湖南 长沙 410082；2.果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室，湖南 长沙 410125；3. 湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南 长沙 410125)

新橙皮苷是柑橘果实中一种重要的二氢黄酮类物质[1-2]，结构见图1。经过催化加氢后可生成具有强烈甜味的新橙皮苷二氢查尔酮[3-6]。 新橙皮苷二氢查尔酮因其高甜度、低热量、无毒性等特性被广泛使用于食品、饲料和药品等领域[7-11]。随着新橙皮苷二氢查尔酮需求量的增加，直接从柑橘果实中提取的新橙皮苷已远远不能满足市场需求。

图1 橙皮苷结构式

为拓宽新橙皮苷的来源和充分开发柑橘果实中的黄酮资源，可以采用根皮乙酰苯-4′-β-新橙皮糖苷(Phloroacetophenone-4′-β-neohesperidoside, PN)在催化体系下与异香兰素反应得到新橙皮苷[6,12-14]。具体工艺路线如图2所示。PN与异香兰素在催化条件下形成新橙皮苷属于羟醛缩合反应，该步反应需要加入催化剂才能进行[15]。

图2 PN合成新橙皮苷工艺路线

现有研究使用的催化体系包括强碱催化[6]、杂环化合物催化[1,6,16]和氨基酸催化[6,13,17]。强碱作为催化剂时，催化产率较低；杂环化合物(如四氢吡咯)作为催化剂时，反应需使用惰性气体进行保护且反应产物的纯度也不理想[1,12]；而氨基酸催化较之前两种方法无论是收率还是纯度均较有优势。目前氨基酸催化已成为PN工业合成新橙皮苷的较优选择，但现有以氨基酸作为该反应催化剂的研究中，未见到酸碱条件对羟醛缩合反应的影响。

本研究比较了强碱、杂环化合物和氨基酸3类催化剂对PN合成新橙皮苷的催化效果，分析了pH对氨基酸催化PN合成新橙皮苷的影响，并对PN合成新橙皮苷的工艺进行了优化，以期为柚皮苷制备新橙皮苷提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

柚皮苷(98%)，湖南佳沐生物科技有限公司；新橙皮苷标准品(98%)，北京世纪奥科生物技术有限公司；异香兰素、L-脯氨酸、L-高脯氨酸、四氢吡咯、吡咯、呋喃、吗啡啉、吡啶、氢氧化钠，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；其余试剂均为市售分析纯。

1.1.2 仪器

85-2B恒温磁力搅拌器，江苏金怡仪器有限公司；LGJ-25C冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；PHS-3C酸度计，上海仪电科学仪器有限公司；Perkin-Elmer 2000傅里叶变换红外光谱仪，美国PE公司。

1.2 试验方法

1.2.1 柚皮苷制备PN

称取160.00 g柚皮苷缓慢加入到1.00 L 4.00 mol/L氢氧化钠溶液中，放在磁力搅拌器上充分搅拌使柚皮苷完全溶解后升温至85℃，反应2 h后停止加热。冷水浴使溶液温度降至室温，使用盐酸将溶液调至pH 6±0.5。继续冷水浴冷却至析出黄色固体，升温至70℃～75℃使固体部分溶解，停止加热室温析晶2 h，减压过滤。滤饼加入500 mL纯水加热至75℃溶解，重结晶两次，减压过滤后将滤饼冷冻干燥，得到PN用于后续试验。

1.2.2 催化PN合成新橙皮苷

称取一定量的PN加入三口瓶中，加入无水乙醇加热搅拌溶解，再依次加入催化剂和异香兰素，充分搅拌溶解后回流加热。其中杂环化合物催化体系(吡咯+乙酸、四氢吡咯+乙酸、呋喃+乙酸、吗啡啉+乙酸、吡啶+乙酸体系)充入氮气进行保护，充分搅拌反应后冷却至30℃后过滤，用等体积4℃预冷的无水乙醇洗涤滤饼，滤饼冷冻干燥，得到灰白色的新橙皮苷并计算产率。

1.2.3 新橙皮苷含量与产量测定

参考梁曾恩妮[3]和郭绮丽等[18]的方法采用HPLC法检测产物。具体为使用甲醇配置0.01 mg/mL～0.10 mg/mL的新橙皮苷标准品溶液，以峰面积为纵坐标，新橙皮苷含量为横坐标制备新橙皮苷标准曲线。再称量已干燥至恒重的新橙皮苷20.00 mg，溶解定容至100.00 mL ，摇匀后进行测试。根据制得的标准曲线计算新橙皮苷样液浓度后求得各组新橙皮苷实际产量。

1.2.4 新橙皮苷的测试方法

对产物进行红外光谱测试分析(FT-IR)。具体为称取少量充分干燥的产物固体粉末使用溴化钾压片法进行压片处理，压片后使用Perkin-Elmer 2000傅里叶变换红外光谱仪进行测试，扫描范围为500 cm-1～4000 cm-1，扫描分辨率为4 cm-1。

1.2.5 PN合成新橙皮苷关键参数优化

以新橙皮苷的产率为指标，在选定催化剂的基础上考察反应温度、时间、催化剂用量、酸碱度等因素对新橙皮苷产率的影响，对试验中各参数进行优化。

1.2.6 数据计算与分析

前述步骤的产率计算如式(1)：

A=m1/m0×100%

(1)

其中：A为反应产率，%；m1为所得产物质量，g；m0为计算所得最大质量(理论质量)，g。

2 结果与分析

2.1 不同催化体系对PN合成新橙皮苷产率的比较

在本试验中使用氢氧化钠、L-脯氨酸、L-高脯氨酸、吡咯+乙酸、四氢吡咯+乙酸、呋喃+乙酸、吗啡啉+乙酸、吡啶+乙酸8种体系对反应进行催化。反应条件为PN为3 g，反应料液比(w/v)1∶10，催化剂、异香兰素与PN摩尔比为1∶1∶1，反应温度为80℃，反应时间120 min。各组反应产率见表1。结果表明，2种氨基酸催化剂体系(L-脯氨酸体系、L-高脯氨酸体系)有较高催化产率，而杂环化合物中的四氢吡咯+乙酸催化体系产率次之，且与前两者差异极显著，其余5种催化体系基本不反应。

表1 不同催化体系下新橙皮苷的产率

PN与异香兰素在催化条件下合成新橙皮苷属于羟醛缩合反应。在试验条件中，催化剂在溶剂体系中形成亲核试剂攻击根皮乙酰苯-4′-β-新橙皮糖苷羰基的α碳原子，形成碳负离子作为亲核试剂攻击异香兰素的醛基使得碳链延长，再在加热条件下脱去水成环后生成新橙皮苷[1,12]。因此催化体系对这一反应的最终产率影响极大。使用氢氧化钠作为催化剂时，可能需要大幅度提高催化剂及异香兰素的使用量或者反应效率较低，因此在本试验条件下几乎不反应。选用四氢吡咯+乙酸作为催化时，可能需要将反应时间延长至8 h～12 h才能达到较好的催化效果[19]，本试验中反应时间仅为120 min，因此产率较低。四氢吡咯+乙酸体系除反应时间较长外，还需要通入保护气防止四氢吡咯因氧化影响催化效果，并且四氢吡咯在生产过程中容易挥发损失[12,20]。在所有催化体系中L-脯氨酸和L-高脯氨酸的催化效果最好。在试验中两者的催化产率未表现出显著性差异，但由于L-脯氨酸价格远低于L-高脯氨酸，在生产成本上具有明显优势。因此，综合反应条件、反应时间、生产成本和产品质量等多方面因素考虑，认为 L-脯氨酸适合作为催化剂应用于PN合成新橙皮苷的生产。

2.2 新橙皮苷的测试分析

PN经过催化反应后得到淡黄色的新橙皮苷产物，重结晶纯化后对其进行红外光谱测试，得到产物的红外光谱见图3。由图可知在波数3415.25 cm-1附近存在酚羟基引起的伸缩振动特征峰，在波数2926.90 cm-1附近存在鼠李糖六元环上的饱和烃甲基C-H引起的伸缩振动特征峰，在波数1646.20 cm-1附近存在C=O引起的伸缩振动特征峰，在波数1519.47 cm-1附近存在苯环骨架特征峰，在波数1367.10 cm-1附近存在甲基C-H引起的弯曲振动特征峰，在波数1071.53 cm-1附近存在Ar-O-R引起的弯曲振动特征峰，在740.77 cm-1附近存在C-H的面外弯曲振动特征峰。以上特征峰与先前报道中的信息一致，因此可判断合成产物为新橙皮苷[6,15]。

图3 新橙皮苷产物的红外谱图

2.3 合成新橙皮苷催化条件的优化

2.3.1 反应温度对PN合成新橙皮苷产率的影响

以L-脯氨酸为反应催化剂，在PN质量3 g，反应料液比(w/v)1∶10，催化剂、异香兰素与PN摩尔比为1∶1∶1，反应时间120 min的试验条件下，考察反应温度对合成新橙皮苷产率的影响。

由图4可知，反应温度在80℃以下，PN的产率随着反应温度升高而增加，80℃后不再增加。其原因可能是由于该羟醛缩合反应常数较小，一定范围内升高温度可以使形成的中间产物脱水闭环形成新橙皮苷，从而增加产率[6]。考虑到乙醇沸点、生产成本与难度等原因，认为80℃为PN合成新橙皮苷的最佳反应温度。

图4 不同温度下新橙皮苷的产率

2.3.2 催化剂用量对PN合成新橙皮苷产率的影响

在反应料液比(w/v)1∶10，反应时间120 min，异香兰素与PN摩尔比为1∶1，反应温度为80℃的试验条件下，考察催化剂用量对合成新橙皮苷产率的影响。

由图5可知，当L-脯氨酸与PN摩尔比未达到1∶1时实际合成率较低且产率随L-脯氨酸用量增加而升高。当L-脯氨酸与PN摩尔比达到1∶1时，产率不再增加。L-脯氨酸在反应体系中的作用主要为帮助PN形成碳负离子与异香兰素进行羟醛缩合，因此当L-脯氨酸用量较少时催化剂与底物因未充分接触而影响产率[6]。

图5 不同催化剂用量下新橙皮苷的产率

2.3.3 反应时间对PN合成新橙皮苷产率的影响

在反应料液比(w/v)1∶10，催化剂、异香兰素与PN摩尔比为1∶1∶1，反应温度为80℃的试验条件下，考察反应时间对合成新橙皮苷产率的影响。

由图6可知，在120 min以下时，延长反应时间可以提高新橙皮苷的产率，在120 min后达到平衡。这可能由于反应底物之间或者底物和催化剂之间并未充分接触[6,12]。因此可以通过适度延长反应时间达到提高产率的目的。

图6 不同反应时间下新橙皮苷的产率

2.3.4 pH对PN合成新橙皮苷产率的影响

在反应料液比(w/v)1∶10，反应时间120 min，催化剂、异香兰素与PN摩尔比为1∶1∶1，反应温度为80℃的试验条件下，调整反应体系的pH(未调整时反应体系pH 6.30)探究pH对PN合成新橙皮苷产率的影响。

结果表明，在一定范围内使用乙酸降低反应的pH或者使用氢氧化钠增加体系的pH都能提高反应产率(图7)。原因可能是在酸性条件下羰基氧原子质子化，增加了羰基的诱导作用促使α-氢解离形成碳负离子，提高反应产率；但当酸性过强时，由于新橙皮苷溶解度提高和糖苷水解等原因，最终产率会有所下降。在弱碱性条件，碱能够帮助α-碳离子脱氢产生共振杂化物，形成碳负离子，从而提高反应产率；而碱性过强时会增加新橙皮苷的溶解性，并可能引起新橙皮苷开环形成新橙皮苷查尔酮，导致产率显著降低。使用L-脯氨酸催化根皮乙酰苯-4′-β-新橙皮糖苷合成新橙皮苷时，增加pH或者降低pH都能提高催化产率。但值得注意的是，使用氢氧化钠增加反应体系的pH，虽然能增加产率，但所得产品颜色较深，纯度较低，并且增加程度也不及使用乙酸降低反应体系的pH。因此，在生产中降低反应体系的pH较增加反应体系的pH更为可行。

图7 不同pH下新橙皮苷的产率

3 结论

本试验对PN合成新橙皮苷的催化体系进行筛选并对反应条件进行优化。发现四氢吡咯+乙酸、L-脯氨酸和L-高脯氨酸对此反应具有催化作用，L-脯氨酸和L-高脯氨酸效果明显优于四氢吡咯+乙酸体系， L-脯氨酸与L-高脯氨酸相比在经济上更为可行。采用L-脯氨酸催化反应，料液比(w/v)1∶10，催化剂、异香兰素与PN摩尔比为1∶1∶1，反应温度为80℃，反应时间120 min时催化PN合成新橙皮苷有最佳产率。此外，研究pH对反应的影响发现，不管是增加pH还是降低pH都能提高催化得率，但综合产物纯度、产量等因素认为在生产中降低反应体系的pH较增加反应体系的pH更为可行。