TRIM26 在人和小鼠主要组织器官中的表达谱

廉 梅林晓琳贾俊双肖胜军肖 东*

(1.南方医科大学基础医学院,广州 510515；2.南方医科大学实验动物管理中心,广州 510515；3.桂林医学院第二附属医院病理科,广西 桂林 541199)

TRIM(三结构域蛋白,Tripartite motif)家族蛋白具有高度保守的RBCC 结构域,由众多的成员组成,广泛存在于大多数动物体内,具有免疫调节和E3泛素连接酶活性,可参与机体的免疫应答过程和泛素依赖的蛋白酶体介导的蛋白质降解[1]。 大多数TRIM 蛋白由一个RING 锌指结构域、一个或两个B-box 结构域和一个卷曲螺旋结构域(coiled-coil,CC),又被称为RBCC 结构域[2]。 到目前为止已经发现了70 多个人源TRIM 蛋白,它们在机体中参与了多种生物过程和疾病发病机制的调控过程。

TRIM26/ZNF173/RNF95 基因位于6 号染色体的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)区域[3]。 TRIM26 由一个RING 锌指结构域、一个B-box 2 结构、一个卷曲螺旋结构域和一个PRY-SPRY 结构域[4]组成；其中锌指结构域结合DNA,参与基因表达调控,RING 结构域具有E3 泛素连接酶的活性[5],B-box 2 结构域参与蛋白泛素化修饰调节,PRY-SPRY 结构域对免疫应答有调控作用,可以促进多聚信号复合体的形成[6]。 迄今,为数不多的研究表明,TRIM26 具有E3 泛素连接酶的活性[7],其在呼吸道疾病[8]、抗HIV-1 感染[9]和作为精神分裂症的易感基因[10]等方面发挥着重要作用。 此外,E3 连接酶TRIM26 通过泛素化降解核内的IRF3 负向调控IFN-β 的产生和抗病毒免疫反应[11]；TRIM26 是抗RNA 病毒先天免疫反应的一个重要调节因子[12]。

最近有研究表明,TRIM26 与肿瘤有一定关系。Mule 和TRIM26 介导的NEIL1 泛素化依赖调节是细胞DNA 损伤反应所需要的,RNA 干扰沉默TRIM26 表达可增强人骨肉瘤U2OS 细胞对放疗的抵抗性[13]。 TRIM26 可通过泛素化调节NTH1 参与人结直肠癌HCT116 细胞对氧化应激敏感性的调控,RNA 干扰沉默TRIM26 表达可增强对过氧化氢(H2O2)所致HCT116 细胞氧化应激损伤的保护作用[14]。 此外,RT-qPCR、基因芯片和原位杂交等研究结果显示,TRIM26 在鼻咽癌组织中表达显著下调；同时,基因芯片数据亦揭示,在下调最明显的10个基因中,TRIM26 位于第4 位[15]。 新近研究亦证实,鼻咽癌组织中TRIM26 表达下调与鼻咽癌低免疫反应密切相关[16]。 总之,目前对TRIM26 在肿瘤发生、发展中的调控作用仍然知之甚少,还有待进一步的探索。

为明确TRIM26 在人和小鼠主要组织器官上的表达谱,本文通过免疫组织化学技术检测TRIM26在正常人体和小鼠组织器官中的表达,了解该基因在不同组织上的表达定位情况,再结合BioGPS 数据库和RT-qPCR 对TRIM26 在组织上的表达水平进行分析。 通过表达定位和表达水平的综合分析,明确该基因在人和小鼠主要组织器官上的表达谱,将为利用TRIM26 条件性敲除小鼠解析TRIM26 在不同组织器官的功能及其在肿瘤等疾病发生发展过程的作用及其分子调控机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF 级C57BL/6 小鼠,雌性5 只,30 ～35 日龄,体重15～17 g,购买于南方医科大学实验动物中心[SCXK(粤)2016-0041],饲养在南方医科大学实验动物中心SPF 实验动物部[SYXK(粤) 2016 -0167]。 实验方案通过南方医科大学实验动物伦理审查委员会审批(L2017068),符合3R 原则。

1.1.2 实验组织

正常人体组织标本来自桂林医学院第二附属医院病理科,取自手术切除器官病变旁正常组织(标本来源经桂林医学院第二附属医院伦理委员会批准并由患者签署知情同意书)。 肝(10 例),胃(7例),肺(6 例),结肠、胰腺、肾和脾(各5 例),食管和子宫内膜(各4 例),甲状腺、皮肤和乳腺(各3例),脑和卵巢(各2 例)。 所有组织经病理学检查不含癌组织。

1.2 主要试剂与仪器

无水乙醇、二甲苯、氯仿、异丙醇(天津市大茂化学试剂厂)；TRIM26 抗体(ab188017) (美国Abcam 公司)；PBS 缓冲液粉末、柠檬酸盐修复液(pH6.0)、封闭用羊血清(工作液)、兔二步法试剂盒(内源性过氧化物酶阻断剂、酶标山羊抗兔IgG 聚合物)、DAB 显色试剂盒(20X)、苏木素染色液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；TRIzol、PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa 公司)。 荧光定量PCR 仪(LightCycler®96,瑞士Roche 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 标本处理

4%多聚甲醛溶液固定组织24 h,常规石蜡脱水、包埋、切片(4 μm)(为减少误差,相同器官组织包埋于一个蜡块上)。

1.3.2 免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色

选择PV-9000 二步法(非生物素):石蜡切片经脱蜡、水化、抗原修复后,滴加一抗并4℃过夜；酶标山羊抗兔IgG 聚合物37℃孵育30 min,DAB 显色(显色时间控制一致),苏木素复染,经过梯度乙醇与二甲苯脱水,最后中性树脂封片后在光镜观察并拍照。 阴性对照为PBS 代替一抗。

1.3.3 免疫组织化学结果判读

免疫组织化学染色,呈棕黄色为阳性,不着色为阴性。 结果由两位桂林医学院第二附属医院病理科医生独立判读TRIM26 所表达的组织部位并评分,根据阳性信号强度不同分为0 ～3 分,分别代表TRIM26 在组织上不表达、弱阳性表达、中等阳性表达和强阳性表达,统计评分结果,确定该基因在不同组织上的表达强度。 阴性对照不着色为不表达。

1.3.4 BioGPS 数据库分析

利用BioGPS 数据库中的Gene Atlas U133 A,gcrma(http://biogps.org/)数据集,分析TRIM26 在人的主要组织器官中的mRNA 表达水平,并用GraphPad Prism 5 做柱形图。

1.3.5 小鼠组织RNA 提取和实时荧光定量PCR反应(quantitative real time polymerase chain reaction,RT-qPCR)

收取小鼠主要组织器官,按说明书抽提总RNA和逆转录反应。 以获得的cDNA 为模板,设计引物进行RT-qPCR 检测。 选择GAPDH 基因作为内参照,检测TRIM26 的表达；选择在小鼠组织中表达量最低的组织为1,其他组织器官按其相对表达量作图。

小 鼠 GAPDH 上 游 引 物 序 列: 5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游引物序列:5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′；小鼠TRIM26 上游引物序列:5′-TCGGCCAGTGGATACCTACAT-3′,下游引物序列:5′-TGGCTCACAGTCAAACTGCTG-3′。

2 结果

2.1 人体主要组织器官中TRIM26 的表达谱

对不同人体组织的IHC 染色结果进行评分,染色呈深棕色为强表达,不着色为不表达。 IHC 结果分析显示,TRIM26 蛋白主要定位于细胞质中,少部分组织定位于细胞核,同一组织的表达定位在多例标本中一致(图1)。 在食管鳞状上皮细胞(图1A)、胃底腺上皮细胞(图1B)、小肠和结肠的上皮细胞(图1C、1D)、肝细胞(图1E)、胰岛细胞(图1F)、脑神经元和胶质细胞(图1G)、气管及支气管纤毛柱状上皮细胞(图1H)、肺泡腔内巨噬细胞及上皮细胞(图1I)、脾血窦内皮细胞(图1J)、肾小管和肾球囊壁上皮细胞及肾小球细胞(图1K)、卵巢间质细胞(图1L)、子宫内膜腺上皮细胞(图1M)、甲状腺滤泡上皮细胞(图1N)、乳腺小叶上皮细胞(图1O)和鳞状上皮细胞(图1P)中TRIM26 均有表达,但在以上这些组织中,乳腺小叶上皮细胞和胰岛细胞中TRIM26 表达较强。

2.2 TRIM26 在人体主要组织器官中的相对表达水平

根据BioGPS 数据库中的Gene Atlas U133A,gcrma 数据集,以数据库中TRIM26 表达量最低的卵巢组织为1,其它组织器官按其相对表达量作图。TRIM26 在人的主要组织器官上的mRNA 表达量见图2。 TRIM26 在气管、肝和甲状腺上的表达水平较高,并且该基因在胰岛细胞上的表达量高于其在胰腺组织上的表达量。

2.3 IHC 揭示小鼠主要组织器官中TRIM26 表达谱

对小鼠组织的IHC 染色结果进行评分,染色呈深棕色为强表达,不着色为不表达。 IHC 结果分析显示,TRIM26 在小鼠细胞的细胞质与细胞核中均有表达(图3)。 TRIM26 表达于食管鳞状上皮细胞及附属腺体(图3A)、胃上皮细胞(图3B)、小肠和结肠上皮细胞(图3C、3D)、胰岛细胞及外分泌腺(图3E)、脑神经元及胶质细胞(图3F)、细小支气管上皮细胞及肺泡上皮细胞(图3G)、肾小管上皮细胞和肾小球细胞(图3H)以及子宫内膜腺上皮细胞(图3I)。

2.4 RT-qPCR 揭示TRIM26 在小鼠主要组织器官中的表达水平

RT-qPCR 检测了TRIM26 在小鼠组织中的表达量,结果如图4 所示。 选择在小鼠组织中表达量最低的心脏为1,其它组织器官按其相对表达量作图。结果显示,TRIM26 在小鼠的脾、肺和胰腺组织上的表达量相对较高。

图1 TRIM26 在人体主要组织器官中的表达Note.A, Esophagus.B, Stomach.C, Small Intestine.D, Colon.E, Liver.F, Pancreas.G, Brain.H, Trachea.I, Lung.J, Spleen.K, Kidney.L, Ovary.M, Endometrium.N, Thyroid.O, Breast.P, Skin.Figure 1 Expression of TRIM26 in human tissues and organs

图2 TRIM26 在人体主要组织器官中的相对表达量Figure 2 The relative expression of TRIM26 in human tissues and organs

3 讨论

本研究通过IHC 和RT-qPCR 明确了TRIM26基因在人和小鼠主要组织器官中的表达定位及相对表达量。 研究发现,TRIM26 在细胞核与细胞质中均有表达,且多表达于上皮细胞,其表达定位在人和小鼠的主要组织器官中具有高度的一致性,同时表达于食管鳞状上皮,胃、小肠和结肠的上皮细胞,胰岛细胞,脑神经元和胶质细胞和子宫内膜腺上皮细胞等。

根据文献报道,TRIM 蛋白参与调控肿瘤的发生发展[5],这与蛋白在组织中的表达与定位密切 相 关。 在 结 直 肠 癌 中,Williams 等[14]发 现TRIM26 通过泛素化调节NTH1 实现人结直肠癌HCT116 细胞对氧化应激敏感性的调控；本研究证实,TRIM26 在人和小鼠的结肠上皮细胞上有表达,可进一步通过基因修饰小鼠探究该基因在结直肠癌进程中的调控方式。 Wang 等[17]发现TRIM26 在肝癌临床组织标本中的表达水平量明显下调,且该基因表达缺失与肝细胞癌的恶性程度密切相关；本研究中,TRIM26 表达于肝细胞胞质中,以上结果提示TRIM26 可能发挥抑癌基因的功能,降低该基因在肝细胞上的表达水平,可接下来探讨其表达缺失与肝癌发生的相关性。另外,赵学英等[18]和李振强等[19]分别在胶质瘤细胞中过表达和沉默TRIM26 表达,证实TRIM26 正向调控了胶质瘤细胞的增殖,并与患者的预后呈负相关。 本研究发现,TRIM26 在人和小鼠的脑胶质细胞中均有较强的表达,这提示TRIM26 在胶质细胞中表达水平变化可能引起细胞功能的改变。 由此可见,明确TRIM26 的表达定位与表达水平在研究肿瘤的发生发展过程中具有重大意义。 然而,目前对于TRIM26 在人和小鼠主要组织器官中的功能还知之甚少,还有待进一步深入研究。

图3 TRIM26 在小鼠主要组织器官中的表达Note.A, Esophagus.B, Stomach.C, Small Intestine.D, Colon.E, Pancreas.F, Brain.G, Lung.H, Kidney.I, Endometrium.Figure 3 The expression of TRIM26 in different tissues and organs of mice

图4 TRIM26 在小鼠主要组织器官中的相对表达量Note.WAT, White adipose tissue.Figure 4 The relative expression of TRIM26 in different tissues and organs of mice

此外,本研究发现TRIM26 在胰岛细胞上的表达尤为明显,IHC 结果显示,该基因在胰岛细胞上的表达强度明显高于胰腺外分泌腺细胞,在小鼠胰腺上亦得到了类似的结果。 可见,TRIM26 在胰岛细胞上可能发挥重要而特殊的功能。 根据此结果,本课题组已委托南京大学-南京生物医药研究院构建了TRIM26 条件性基因敲除小鼠,拟再与Pdx-Cre 小鼠交配,获得胰岛 β 细胞特异性敲除TRIM26 的C57BL/6 小鼠,进而探究该基因在胰岛细胞上的功能。

本实验在对成人组织与成年小鼠的研究中发现,TRIM26 表达具有一定的组织器官特异性,提示其功能的复杂性和组织器官依赖的特征。 为深入探究TRIM26 在生长发育过程中承担的生物学功能,本课题组将利用小鼠进一步明确TRIM26 在胚胎发育至老龄化过程中的不同时期、不同组织器官中RNA 表达水平及蛋白表达量的变化,完善该基因在不同时间与空间的表达谱和功能谱,不仅为后续探索TRIM26 基因在组织发育中的分子调控机制奠定基础,同时对于利用基因修饰小鼠阐明该基因在研究肿瘤的发生发展过程中的作用也是十分重要的。