绵羊IRS1基因CDS区克隆、序列分析及其组织表达研究

王建清，郝志云，沈继源，王继卿，罗玉柱，胡 江，刘 秀，李少斌

（甘肃农业大学 动物科学技术学院/甘肃省草食动物生物技术重点实验室/甘肃省牛羊基因改良工程实验室，甘肃兰州 730070）

【研究意义】胰岛素受体底物（insulin receptorsubstrates，IRSs）是细胞质蛋白，在下游信号传递中起着重要的级联作用。【前人研究进展】目前在IRSs 家族中共发现6 名成员，分别是IRS1、IRS2、IRS3、IRS4、IRS5 和IRS6。这些蛋白质在N 末端具有较高的同源性，有2 个极其保守的结构域，即血小板-白细胞C激酶底物结构域（pleckstrin homology，PH）和磷酸化酪氨酸结合结构域（phosphotyrosine binding，PTB），前者负责蛋白质相互作用及蛋白质与磷脂相互作用，后者负责与活化受体中的NPXY 基序相互作用[1-2]。胰岛素受体底物1（Insulin receptor substrate 1，IRS1）是细胞胰岛素反应的主要配体和信号转导适配蛋白，在胰岛素（insulin，INS）和胰岛素样生长因子受体1（insulin-like growth factor receptor-1，IGFR-1）向细胞内PI3K/AKT（Phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B）和MAPK（mitogen-activated protein kinase）通路传递信号方面起着关键作用[3]。IRS1作为调节β细胞功能的重要信号分子，主要调节胰岛素分泌。例如，IRS1抑制内质网上钙离子ATP 酶，使细胞内钙离子浓度升高，从而激活蛋白激酶C，刺激了胰岛素释放[4]。IRS1 在生物代谢和生长促进中都发挥着重要的功能，缺乏IRS1 的小鼠表现出轻微的糖尿病表型和明显的生长障碍，即小鼠心脏、肝脏和腓肠肌的重量明显减少[5]。马向辉等[6]研究发现IRS1基因对秦川牛体尺及部分肉质性状有显著的影响。此外，Porter 等[7]分析了人乳腺癌标组织中IRS1的表达，发现IRS1在导管原位癌（DCIS)中高度表达。Jiao 等[8]研究发现miR-221 通过靶向PI3KAkt/mTOR 信号通路中的关键基因IRS1，抑制了奶牛乳腺上皮细胞的增殖。由此表明IRS1基因在乳腺发育中也具有重要的生物学功能。【本研究切入点】目前在GenBank中已有绵羊IRS1基因的预测序列，但尚未经过实验证实。同时也尚未见到绵羊该基因的序列特征和mRNA 组织表达研究。【拟解决的关键问题】本研究以泌乳高峰期和空怀期的小尾寒羊为研究对象，利用克隆测序技术获得了绵羊IRS1基因的CDS序列，通过生物信息学分析了其编码的氨基酸序列，利用RT-qPCR 检测了在不同乳腺发育时期，IRS1基因在乳腺、肝脏、心脏、背最长肌、脾脏、肺脏、卵巢和肾脏中的表达模式，以期为阐明IRS1基因的生物学功能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 绵羊组织样的采集

在甘肃省天祝县松山镇金子河绵羊繁育场，选择处于泌乳高峰期（产后第3周）的小尾寒羊和空怀期的小尾寒羊各3 只，所有羊只均为健康无病的3 岁母羊。现场屠宰后分别采集其乳腺、心脏、肝脏、背最长肌、脾脏、肺脏、卵巢和肾脏组织，用DEPC 水冲洗干净后装入2 mL冻存管，然后迅速置于液氮中，带回实验室，于-80 ℃冰箱中保存，备用。

1.2 绵羊组织样总RNA的提取与反转录

按照Trizol Reagent（Invitrogen，CA，USA）试剂盒说明，分别提取小尾寒羊各组织中的总RNA，用20 g/L的琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计（NanoDrop™One）检测所提RNA 的质量和浓度。检测合格的RNA 按照天根反转录试剂盒（FastKing RT kit with gDNase）的要求进行反转录得到cDNA，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3 绵羊IRS1基因的引物设计与PCR扩增

利用人IRS1基因的mRNA 序列（GenBank 登录号为NM_005544.2），在NCBI 中BLAST 搜索绵羊基因组4.0（Ovine Genome Assembly Oar_v4.0），获得与人IRS1mRNA高度相似的绵羊序列。用Primer 5.0设计3 对引物P1、P2 和P3，其中P1 和P2 引物用于克隆扩增绵羊IRS1基因的CDS 全长序列，引物P3 用于RTqPCR 分析，β-actin作为RT-qPCR 的内参基因，这些引物由杨凌天润奥科生物科技有限公司合成，引物具体序列见表1。以一只空怀期小尾寒羊的背最长肌中获得的cDNA 为模板，采用25µL 反应体系进行PCR 扩增：cDNA（约100 ng/µL）1µL、2×F8 FastLong PCR MasterMix 12.5µL、上、下游引物（0.25µmol/L）各0.5µL，加ddH2O 至25µL；PCR 扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性15 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸50 s，共37个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

表1 绵羊IRS1基因的引物序列Tab.1 Primer sequence for sheep IRS1 gene

1.4 绵羊IRS1基因的克隆和测序

PCR 扩增产物用10 g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测，用天根琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒纯化回收目的片段，将回收的目的片段连接至pMD19-T 载体上，连接反应体系为：0.5µL pMD19-T 载体（约50 ng）、2 µL 目的片段DNA（约150 ng）、5 µL solutionⅠ快速连接液、最后用灭菌去离子水补足到10 µL，16 ℃连接30 min。将连接产物加到100µL DH5α感受态细胞中混匀冰浴30 min，42 ℃水浴90 s，取出后立即冰浴5 min，然后向其中加入500µL、37 ℃预热的LB（不含抗生素）培养基，200 r/min、37 ℃培养45 min，吸取200 µL 菌液加到含Amp 抗生素的LB 固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将菌液均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板于37 ℃培养14 h。然后挑取白色单菌落加入1 mL 含Amp 抗生素的LB 培养基中，在220 r/min、37 ℃下培养10 h，用引物P1和P2分别进行菌液PCR扩增（扩增体系及条件参考1.3），对PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，对于检测到目的条带的PCR 产物所对应的菌液，送至上海生工生物科技有限公司测序。

1.5 绵羊IRS1基因的生物信息学分析

通过在线软件（http：//hollywood.mit.edu/GENSCAN.html）预测绵羊IRS1基因的CDS 及其编码的氨基酸序列，并在NCBI 中进行Blast 验证；用MEGA 5.0 构建系统发育树；用在线软件（https：//web.expasy.org/protparam）分析绵羊IRS1的氨基酸序列特征；用在线软件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析其蛋白质二级结构；用NetPhos 3.1预测氨基酸序列中潜在的磷酸化位点；利用在线软件（https：//string-db.org/cgi/input.pl）分析IRS1的蛋白网络互作关系；利用KEGG和GO分析其生物学功能和参与的代谢通路。

1.6 绵羊IRS1基因的表达量检测

用SYBR Green I 嵌合荧光法，在Applied Biosystems QuantStudio®6 Flex qPCR 仪（Thermo Fisher，USA)中进行qPCR 反应，用于检测IRS1基因的组织表达量，然后用2-△△Ct法进行相对定量分析。qPCR 采用20µL 反应体系，包括2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10µL、上、下游引物（0.25µmol/L）各0.4µL、cDNA（约50 ng/µL）2µL，加ddH2O 至20µL；反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环，然后进行融解曲线分析：95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，95 ℃变性15 s。绵羊IRS1基因表达量检测所用的cDNA 分别来自泌乳高峰期小尾寒羊和空怀期小尾寒羊的8 个组织，每个组织3个生物学重复。

2 结果与分析

2.1 绵羊IRS1基因的PCR扩增

以小尾寒羊背最长肌中获得的cDNA 为模板，用引物P1 和P2 进行PCR 扩增，扩增产物经10 g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测，发现2 条目的条带均接近2 000 bp，与预期结果一致（图1）。

图1 绵羊IRS1基因PCR扩增产物检测结果Fig.1 Electrophoresis results of sheep IRS1 gene PCR product

2.2 绵羊IRS1基因的克隆测序

通过测序发现，引物P1 和P2 扩增的核苷酸片段大小分别为1 840 bp和1 935 bp，将这2段核苷酸序列拼接后，获得了绵羊IRS1基因的CDS及其编码的氨基酸序列。结果表明，该基因的CDS全长3 708 bp，编码1 235个氨基酸，这与NCBI中预测的结果一致。利用BLAST分析发现，该氨基酸序列与山羊IRS1 序列和黄牛IRS1 序列同源性分别高达99.19%和98.22%。在GenBank 中获得山羊（XP_017914353.1）、野牦牛（XP_005890195.1）、黄牛（XP_003585821.1）、马（XP_023498214.1）、猪（XP_020930260.1）、大鼠（NP_037101.1）、小鼠（NP_034700.2）和人类（NP_005535.1）IRS1 的氨基酸序列，结合本研究获得的序列，构建了系统发育树。结果显示，本研究获得的绵羊序列与山羊IRS1序列的亲缘关系最近，其次是野牦牛和黄牛，与猪、马和人的亲缘关系较远，与小鼠和大鼠的亲缘关系最远（图2）。以上研究结果表明，本研究获得的核苷酸序列为绵羊的IRS1序列。

2.3 绵羊IRS1的蛋白理化性质及其生物学功能分析

绵羊IRS1的分子式为C5615H8814N1706O1800S45，分子量为130 462.80，等电点为8.99，包括507个非极性氨基酸（41.1%）和728 个极性氨基酸（58.9%），其中极性氨基酸由124 个带正电荷的氨基酸（Arg+Lys）（10.0%）、108个带负电荷的氨基酸（Asp+Glu)（8.7%）和496个不带电荷的氨基酸（40.2%）组成。在其氨基酸组成中，丝氨酸（Ser）含量最高，占比为14.6%；其次是脯氨酸（Pro）和甘氨酸（Gly），分别占10.7%和10.6%。绵羊IRS1 在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30 h，脂溶指数为56.06，平均亲水性为-0.649，不稳定指数为73.55。说明该蛋白为不稳定的、碱性亲水性蛋白。

图2 基于IRS1的氨基酸序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of IRS1

绵羊IRS1的二级结构中包含14.01%的α螺旋、4.05%的β 转角、67.53%的无规卷曲和14.41%的延伸链。磷酸化位点预测结果显示，绵羊IRS1 包含了150 个丝氨酸（Ser）、36个苏氨酸（Thr）和18个酪氨酸（Tyr）磷酸化位点。GO 功能注释显示，IRS1基因主要参与了蛋白激酶结合及蛋白激酶C 结合等生物学过程。KEGG 分析发现，IRS1基因主要参与了PI3K/AKT和MAPK信号通路。String分析显示，绵羊IRS1同IGFR1、磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1（Phosphoinositide-3-Kinase Regulatory Subunit 1，PIK3R1）、丝裂原活化蛋白激酶8（Mitogen-Activated Protein Kinase 8，MAPK8）、丝裂原活化蛋白激酶10（Mitogen-Activated Protein Kinase 8，MAPK10）和生长因子受体结合蛋白2（growth factor receptor bound protein 2，GRB2）存在直接的相互作用（图3）。

图3 绵羊IRS1蛋白网络互作图Fig.3 The protein interaction network of sheep IRS1

2.4 绵羊IRS1基因的组织表达特征

RT-qPCR 检测结果分析发现，绵羊IRS1基因在小尾寒羊各组织中均表达，并且表现出明显的组织特异性。无论是泌乳高峰期还是空怀期的小尾寒羊中，IRS1基因在背最长肌中的表达量最高，其次是肝脏和心脏，在肺脏、肾脏、卵巢和乳腺组织中表达量较低，在脾脏中弱表达。

同时，绵羊IRS1基因表达也表现出明显的时序性。在泌乳高峰期的小尾寒羊中，IRS1基因在乳腺组织中的表达量是空怀期乳腺组织中的表达量的2.77倍（P＜0.05），但在除乳腺和脾脏以外的其他6个组织中，该基因在空怀期中的表达量均显著高于泌乳高峰期中的表达量（P＜0.05）。同时发现，虽然在泌乳高峰期中，IRS1基因的表达量在卵巢和乳腺组织间无显著差异（P＞0.05）；但是在空怀期中，该基因在卵巢中的表达量是乳腺组织中的5.49倍（P＜0.01）（图4）。

3 讨论与结论

图4 IRS1基因在泌乳高峰期和空怀期小尾寒羊各组织中的相对表达量Fig.4 Relative expression of IRS1 gene in different tissues of small-tailed han sheep during the peak-lactation and non-lactation periods

本研究利用克隆测序等实验方法，首次获得了绵羊IRS1基因完整的CDS序列。该序列全长3 708 bp，编码1235 个氨基酸。绵羊IRS1 的氨基酸序列与山羊和黄牛IRS1 序列的同源性分别高达99.19%和98.22%。绵羊IRS1 的氨基酸组成中，丝氨酸（Ser）含量最高（占14.6%），这与小鼠中的研究结果一致[2]。绵羊IRS1 的平均亲水性为-0.649，属于亲水性蛋白。Sun 等[9]也发现大鼠IRS1 是相对分子质量为131 000 的亲水性蛋白质。绵羊IRS1 的不稳定指数为73.55，为不稳定蛋白，但其半衰期较长（30 h），这与“蛋白质的稳定性与其半衰期呈正相关”[10]的研究结果有一定出入。绵羊IRS1为不稳定蛋白，有2 个方面的原因。一是绵羊IRS1 的氨基酸序列中含有204 个潜在的磷酸化位点。Sprang 等[11]研究发现磷酸化会降低蛋白质的稳定性。二是绵羊IRS1的不稳定性与其二级结构中含有较少的α螺旋有关。研究表明，二级结构中的α螺旋可以增加蛋白质的稳定性[12-13]。在绵羊IRS1的氨基酸构成中含有高比例的脯氨酸（10.7%）和甘氨酸（10.6%），这影响了α 螺旋的形成。研究表明，不同的氨基酸序列形成α 螺旋结构的概率不同。蛋氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸都有特别高的α 螺旋形成概率，而脯氨酸和甘氨酸的α螺旋形成概率很低[14]，因为脯氨酸可以通过两种途径破坏和扭曲α螺旋，一是不能提供酰胺氢键，另一方面是它对α螺旋的主干进行空间干涉，迫使α螺旋轴弯曲约30°[15]。

KEGG 分析发现，IRS1基因主要参与了PI3K/AKT 和MAPK 信号通路，这2个信号通路都与哺乳动物的乳腺发育和泌乳密切相关。其中PI3K/AKT 是由胰岛素样生长因子1（IGF1）介导的、调节蛋白质合成的信号通路[16]，IGF1 与IGFR1 结合后使得IRS1 发生磷酸化，磷酸化后的IRS1 与PI3K 结合生成PIP3，PIP3 可以吸引并激活AKT 激酶[17-18]，然后在mTOR 通路上促进乳蛋白的合成[19]。MAPK 激酶是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，MAPK 信号通路主要调节细胞增殖、分化、存活和凋亡，以及有丝分裂[20]。研究[5]表明，在IRS1缺失的小鼠中，PI3K/AKT 和MAPK 通路的信号转导受到影响，并且受影响程度是组织特异性的。因此绵羊IRS1可以通过这2个信号通路调节绵羊乳腺和其它组织的发育。

蛋白互作分析发现绵羊IRS1 同IGFR1、PIK3R1、MAPK8、MAPK10 和GRB2 存在直接的相互作用。其中IGFR1 是PI3K/AKT 信号通路的关键蛋白[21]，PIK3R1 和催化亚基（p110a、p110b 和p110d）共同构成了PI3K[22]，IGFR1 可以通过PI3K/AKT 信号通路发挥一系列作用[17]。MAPK8（也称为JNK1）和MAPK10（也称为JNK3）是MAPK 激酶的JNK（c-Jun N-terminal kinases）家族成员[23]，JNK 可以与IRS1 结合，从而使IRS1 在Ser307 位点处发生磷酸化，最终抑制了INS 刺激的IRS1 酪氨酸磷酸化，促进了MAPK 的激活，增强了MAPK 通路的信号转导[24]。在INS 刺激过程中，GRB2 与IRS1 磷酸化的Y895VNI 基序结合，形成IRS1-GRB2复合物，可以增强INS对MAPK的刺激作用[25]。

RT-qPCR 检测结果分析发现，绵羊IRS1基因在小尾寒羊各组织中均表达，并且表现出明显的组织特异性。无论是在泌乳高峰期还是在空怀期，IRS1基因在背最长肌中的表达量最高，其次是肝脏和心脏，在肺脏、肾脏、卵巢和乳腺组织中表达量较低，在脾脏中弱表达。这与人类上的研究结果一致，张垚等[26]发现IRS1在全身各组织细胞中均表达，并且在骨骼肌中表达量最高。目前IRS1基因的组织表达研究集中在人类肿瘤组织中[27]，尚未有该基因在家畜组织中的研究报道。

绵羊IRS1基因也表现出明显的时序表达性，在肝脏、心脏、背最长肌、肺脏、卵巢和肾脏组织中，该基因在空怀期中的表达量均显著高于泌乳高峰期中的表达量（P＜0.05），这可能与绵羊在2个时期的雌二醇分泌量差异有关。华蕊等[28]在海南黑山羊中研究发现，与空怀期相比，泌乳期的雌二醇分泌量显著下降，而雌二醇可以增加IRS1mRNA的表达[29]。

同时发现，IRS1基因在泌乳高峰期乳腺组织中的表达量是空怀期中的2.77倍（P＜0.05），这表明IRS1基因在促进绵羊乳腺发育和泌乳中发挥着重要作用。研究表明在牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺中，INS具有促进细胞增殖和乳蛋白基因表达的作用[30-32]，而IRS1可以抑制内质网上钙离子ATP 酶，使细胞内钙离子浓度升高，从而激活蛋白激酶C，刺激INS 释放[4]。因此，IRS1 可以通过INS 的间接作用促进乳腺上皮细胞增殖。此外，Chen 等[33]研究发现IRS1 可以通过磷酸化激活STAT5，从而参与JAK/STAT 信号转导通路，调控乳蛋白合成和乳腺上皮细胞分化，维持乳腺上皮细胞的存活[34-35]。

本研究首次成功克隆得到绵羊IRS1基因完整的CDS 序列，它全长3 708 bp，编码1 235 个氨基酸。IRS1在小尾寒羊各组织中广泛表达，并且表达出明显的组织特异性和时序特异性。