Streptomyces sp.N2所产农抗N2对桔青霉的拮抗活性及作用机制研究

刘 群，王丽华，陈东海，彭伟建，徐家兴，李昆太*

（1.江西农业大学 应用微生物研究所，江西 南昌 330045；2.江西省医疗器械检测中心，江西 南昌 330029）

【研究意义】桔青霉（Penicillium citrinum）是一种杯霉科真菌，常见于腐烂的水果、蔬菜、木材、肉类、皮革上，多成灰绿色，能够引起木材的腐霉病[1]。我国木材资源相对匮乏，木材再生周期较长，随着天然林保护工程的实施，木材产量难以满足市场需求，目前，在国内外木材防霉防腐研究中，常用处理方法有物理法、化学法和微生物法[2]，物理方法为烟熏、蒸煮及高温热处理等；化学方法为使用有机碘化物、三唑化合物、硼化物和铜基类防霉剂[3]。【前人研究进展】Sharma等[4]研究了放线菌（Streptomyces exfoliatusMT9）分离物对木材腐烂真菌的体外拮抗作用，发现MT9对多种木腐菌表现出强烈的抗真菌活性。Anand等[5]发现紫色链霉菌（Streptomyces violaceusniger）深层发酵产生的溶瘤酶对木材白腐病和褐腐病菌都表现出广泛的抗真菌活性。防霉防腐剂一般情况下都会对人体造成不良影响，对环境有污染，因此采取何种措施提高性能，提高杀菌剂耐久性，降低自身毒性是研究的重点[6]。寻求安全、无毒、有效的拮抗微生物制剂来取代化学药剂是当今的一个重点研究方向[7]。相比于化学防治，生物防治具有安全、无毒和对环境友好等优点。用于植物病原真菌生物防治的微生物主要有木霉属（Trichodermaspp.）、粘帚霉属（Gliocladiumspp.）、芽孢杆菌属（Bacillusspp.）、假单胞菌属（Pseudomonasspp.）和链霉菌属（Streptomycesspp.）[8]。【本研究切入点】其中，链霉菌（Streptomycesspp.）是已知放线菌中最大的簇群，可产生丰富多样的抗菌活性物质，被广泛应用于真菌病害生防[9]。Streptomycessp.N2是本课题组Xu等[10]分离筛选到的一株可产新型抗真菌活性物质（3-甲基-3，5-氨基-4-烯-吡喃-2-酮，分子式为C6H7O2N，农抗N2）的新种，此活性物质对桔青霉具有良好的拮抗效果。【拟解决的关键问题】本文从生长特征、宏观形态特征和微观形态特征等角度初步研究了农抗N2对桔青霉的拮抗作用效果，以期为进一步探讨Streptomycessp.N2对桔青霉的拮抗机理及其生防应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

链霉菌N2（Streptomycessp.N2）由本实验室自行分离筛选获得，甘油管冻存保藏。桔青霉（Penicillium citrinum）由本实验室保存。

1.2 农抗N2粗提物的制备

参照吴志明等[11]将培养7 d 的链霉菌N2 孢子刮入30 mL 带玻璃珠的无菌蒸馏水中，震荡20 min 后，将5 mL 孢子悬液移入装有50 mL 种子培养液（蔗糖20 g，玉米淀粉10 g，玉米浆10 g，硫酸铵1 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁1 g，硫酸锰0.01 g，硫酸锌0.01 g，蒸馏水1 L，pH 7.2～7.4）的250 mL三角瓶中，160 r/min、30 ℃振荡培养48 h即得链霉菌N2种子液。

种子液按10%接种量接入发酵液培养基（蔗糖40 g，玉米淀粉20 g，玉米浆20 g，黄豆饼粉10 g，硫酸铵2 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁1 g，硫酸锰0.01 g，硫酸锌0.01 g，蒸馏水1 L，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌30 min）中，160 r/min、30 ℃培养96 h，收集发酵液。参照杨勇等[12]提取方法，加入2 倍体积工业酒精浸提至少24 h后4 000 r/min离心30 min弃除菌体，上清液经减压浓缩至酒精蒸干后于10 000 r/min离心10 min保留上清液，最后用0.22µm 滤膜过滤除菌即得无菌发酵液原液，用无菌蒸馏水稀释无菌发酵原液制成1.44，2.88，5.77，11.53，23.06µg/mL等不同质量浓度农抗N2药液，备用。

1.3 农抗N2粗提物抑菌作用分析

1.3.1 采用杯碟法[13]测定农抗N2 对桔青霉的抗菌活性 用50 mL 无菌水将桔青霉制成菌悬液后，移取200µL 均匀涂布于PDA（去皮土豆200 g/L，蔗糖20 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.2）培养基上，15 min 后小心放入牛津杯，加入200µL 不同浓度N2 粗提物。以无菌水CK 为对照，各处理重复3 次，72 h 后测定抑菌圈直径并记录。

1.3.2 采用曹等的方法[14]测定农抗N2对桔青霉的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）将农抗N2原液与冷却至45 ℃的PDA 培养基混匀，制成终浓度分别为5.77，2.88，1.44，0.72µg/mL 的含药平板后，将桔青霉菌悬液均匀涂布于药平板表面，置于28 ℃恒温培养箱中培养60 h；以不含农抗N2 的PDA培养基为对照，每处理做5次重复，观察记录桔青霉生长情况，以抑制桔青霉生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

1.3.3 采用菌丝干重法测定农抗N2对桔青霉生长量的变化 将待测桔青霉接种1 mL于50 mL PD液体培养基中，30 ℃、180 r/min恒温培养24 h后；加入适量链霉菌N2无菌发酵液原液使其终浓度达到3.84µg/mL，以加等量无菌蒸馏水培养作为对照，30 ℃，180 r/min 恒温震荡培养。每隔12 h 取样3 个重复，用真空泵将培养基抽干，留取菌丝，并置于80 ℃烘箱中至恒质量，观察桔青霉菌丝在液体培养基中的形态变化，并称量、记录菌丝干质量。

1.3.4 农抗N2粗提物对桔青霉超微结构的影响 将1 mL桔青霉菌悬液接种于50 mL PD液体培养基中。30 ℃、180 r/min恒温培养72 h后，分别加入15 mL、50 mL链霉菌N2无菌发酵液原液，以加等量无菌蒸馏水培养作为对照，每个处理3个对照30 ℃、180 r/min 恒温震荡培养。于48 h后取样，离心机10 000 r/min离心10 min。培养48 h后制备扫描电镜和透射电镜样品。

扫描电镜和透射电镜样品的加工按康振生[15]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 农抗N2对桔青霉的抑菌作用

不同浓度农抗N2作用下的桔青霉抑菌圈直径如表1所示。由表1可以看出，随着农抗N2作用浓度的增加，其对桔青霉的抑制效果愈加强烈。当农抗N2作用浓度为11.53µg/mL 时，桔青霉抑菌圈直径达到（18.66±1.94）mm。

表1 农抗N2对桔青霉抑菌圈平均直径Tab.1 The average diameter of the inhibition zone of Streptomyces sp.N2 against P.citrinum

2.2 农抗N2对桔青霉生长周期的影响

通过测定菌体的生长曲线可以反映微生物对培养基成分的利用情况，以及药物对菌体生长的影响。桔青霉在3.84 µg/mL 农抗N2 作用下的生长情况如图1 所示。由图1 可知，当PD 培养基中不添加农抗N2，桔青霉在24 h 之后进入对数生长期，菌体数量显著增加在第96 h时菌体干质量达1.70 g；而在农抗N2 作用下的桔青霉菌体数量明显少于对照组，其最大菌体干质量仅为1.34 g，这说明农抗N2能够有效抑制青霉细胞的生长与繁殖。

图1 农抗N2对桔青霉生长周期的影响Fig.1 The effects of Streptomyces sp.N2 on growth cycle of P.citrinum

2.3 农抗N2对桔青霉形态学的影响

2.3.1 农抗N2对桔青霉平板菌落形态的影响根据观察和记录的结果（图2）可知：随着农抗N2 处理浓度的升高，桔青霉的抑制作用逐渐增强，菌落紧实且直径明显偏小，菌落呈白色且未经色泽的变化，尤其是在添加5.77µg/mL 农抗N2的平板上桔青霉完全未生长；而对照组菌丝生长较快，菌落整体疏松有明显的绒毛，而且菌落色泽由开始的白色逐渐变成灰绿色、黄绿色。

图2 农抗N2对桔青霉平板菌落形态的影响Fig.2 The effect of Streptomyces sp.N2 on colony morphology of P.citrinum

2.3.2 桔青霉扫描电子显微镜形态观察结果 扫描电子显微镜观察对比发现，对照组桔青霉菌菌丝粗壮均匀，较为光滑，形状完整，饱满圆润（如图3、4）；经低浓度农抗N2（3.84µg/mL）处理的菌丝较稀疏，干瘪变形，布满褶皱（如图3b，3e所示）；而经较高浓度农抗N2（5.32µg/mL）处理的菌丝更为干瘪褶皱，表面更为粗糙，失水畸形，有明显的胞内物质泄露（如图3c，3f）。

2.3.3 桔青霉透射电子显微镜形态观察结果 观察透射电子显微镜图片发现：未经农抗N2处理的桔青霉细胞，细胞核核膜清晰，形状规则完整，细胞膜以及细胞器等结构清晰可见，分布有序，线粒体均匀，细胞内含物无外渗现象（如图4a，4d）；经低浓度农抗N2（3.84µg/mL）粗提物处理的菌丝，细胞膜轮廓不清，细胞内容物有轻微外渗，细胞器有所损伤，有空泡化，细胞内物质密度降低，细胞内出现囊泡，细胞质出现无序化（如图4b，4e）；在高浓度农抗N2（5.32µg/mL）处理下，各细胞器结构紊乱，细胞器未能明显观察，处于降解状态，菌体发生明显的质壁分离，胞内出现大量空腔，细胞内含物大量外渗，细胞核受到显著破坏，轮廓模糊不清，400 000×高倍镜下观察明显发现细胞质密度显著低于对照组（如图4c，4f）。

图3 桔青霉扫描电镜形态观察Fig.3 Morphological observation of P.citrinum under scanning electron microscope

图4 桔青霉透射电镜形态观察Fig.4 Morphological observation of P.citrinum under transmission electron microscope

3 结论与讨论

真菌病害是影响农作物优质高产和植物病害的重要制约因素[16]。据统计，全球每年因植物病害而造成的农业产量下降比例就高达10%～16%[17]，而其中约70%～80%的植物病害是由病原真菌侵染所致[18-19]。袁敏等[20]通过研究表明链霉菌NG-715 所产抗真菌组分对桔青霉具有良好的抑制作用；李汉广等[21]研究发现链霉菌702所产抗真菌活性物质对桔青霉的抑菌活性良好。笔者前期研究发现，Streptomycessp.N2 所产抗真菌代谢物农抗N2 对桔青霉（P.citrinum）、意大利青霉（P.italicum）、指状青霉（P.digitatum）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、棉花枯萎病菌（F.oxysporumf.sp.vasinfectum）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）、莴苣菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）等多种植物病原真菌均具有较强抑菌活性，其中对桔青霉的抑制率高达85.49%[11]，由此说明农抗N2 具备广谱的拮抗植物菌病原真菌特性，这为其在不同类型植物病害上的生防应用奠定了基础，也为本研究进一步探讨农抗N2对桔青霉的拮抗作用机理提供了有力根据。

本文在前期研究的基础上，较系统的从生长特征、细胞形态学等角度，进一步研究了农抗N2对桔青霉所引起的菌落形态及菌体细胞的一系列病变的防治效果。结果表明农抗N2 对桔青霉的菌丝生长具有很强的抑制作用，且具有浓度效应。桔青霉的抑菌圈直径随着农抗N2 处理浓度的增大而增大，农抗N2 对桔青霉的最低抑菌浓度为5.77µg/mL，其对应的抑菌圈直径为（13.04±1.06）mm。应用电镜技术就农抗N2对桔青霉生长的影响进行了研究，结果表明农抗N2对桔青霉的形态和结构有很大的破坏作用，结合文献[22]报道，可以推测农抗N2 能够影响桔青霉细胞壁相关蛋白的合成，使细胞壁的通透性增强，影响其细胞膜及内部细胞器。本实验尽管初步探究了农抗N2拮抗桔青霉的作用机理，但其对桔青霉具体作用位点以及其在自然环境中对木材的防腐效应，工业产量等重点问题还有待进一步研究。