以动物实验探索内质网应激和心肺复苏后脑损伤之间的关系

201199复旦大学附属闵行医院急诊科，上海

对患者实施心肺复苏(CRP)后，会引发不同程度脑损伤，具有较高致残率和死亡率。其中主要原因是由于产生再灌注性损伤，无有效治疗手段。据相关资料表明[1]，内质网应激在缺血再灌注损伤中占据重要作用，缺血预处理可让患者内质网应激得到抑制，使非正常折叠蛋白数量减少，进而减缓脑缺血再灌注，因此为了能够探究内质网应激和CRP 后脑损伤之间关系，本文以实验大鼠为实验活体，拟建立大鼠心脏骤停以及CRP模型，探讨内质网应激和CRP 后脑损伤之间关系，现报告如下。

资料与方法

选取某科研院所提供的体重为300～400 g的健康雄性大鼠，大鼠在实验前及CRP后，按照时间进行分组，分别在1 h、3 h、6 h、12 h 及24 h 等时间点进行分组，5 只/组。大鼠生命体征良好，经测试无重大疾病。在实验前1 天禁食，可饮水。

方法：准备实验器材以及药剂，全套小型动物维持系统设备，包含小动物呼吸机、探针式温度计及气管插管、注射器等。实验药剂包主要有戊巴比妥钠、肝素、肾上腺素等以及各种测定试剂盒，可以对小动物各种生命指标进行检查。①麻醉及术前准备工作：给所有大鼠进行编号分组，并进行称量后确定戊巴比妥钠注射量，按照45 mg/kg 进行麻醉注射，如有中途醒来的应追加戊巴比妥钠10 mg/kg 进行麻醉，并将大鼠麻醉后，固定于手术台上，常规消毒器具、铺巾等，在实验过程中，利用加热灯保持大鼠体温。②气管插管：麻醉后，使大鼠保持仰卧位并进行固定，露出颈部，逐层分离各项组织，使气管暴露，将大鼠舌头拉向一侧，并将气管插管插入气管中，会感受到齿轮型阻力，深度5 cm 左右。术中大鼠会有呕吐反射，成功后可吸去腔内黏液，避免对气管阻塞。③心脏骤停的模型建立：为让大鼠心脏发生骤停，本次研究采取经皮电刺激方诱发。麻醉完成后，暴露前胸，在胸骨左缘第4及右缘第3肋骨处插入无菌针灸针，当发现针灸随心脏跳动后，则已经进入心外膜，再进针深度1 cm，完成后需要和电刺激器相连。设置参数后，诱导大鼠心脏骤停，并持续刺激3 min避免出现复跳。通过生命监测系统对大鼠血压进行监测，血压20 mmHg，则需停止刺激。当动脉波形消失及进行计算无干预6 min 后，开展CRP。④CRP：大鼠心脏骤停6 min后开展CRP，应立即采用呼吸机辅助通气，氧气浓度保持100%，频率80 次/min，气量0.65 mL/100 g，并进行肾上腺素推注(20 μg/kg)并用示指及中指在胸骨下进行按压，3～4次/s，直至自主循环恢复，大鼠窦性心律，且动脉压保持在60 mmHg长达10 min，如达不到10 min 则复苏失败，放弃抢救。⑤CRP 后处理：复苏成功后，将氧气浓度调整为正常值，根据大鼠实际情况，停止机械通气，并在2 h后需要拔出静脉直管以及气管插管，将大鼠放入笼子，进行观察，正常后开展后续实验。

观察指标：对各组大鼠进行脑组织海马RNA 的提取，并对大鼠脑组织海马内质网应激相关标记物的含量进行测定，采用Real time PCR 的方法对海马组织内质网应激相关标记物含量进行检测。脑组织海马蛋白内质网应激标记物表达采用Western blot 的方法测定海马蛋白内GRP 78、XBP-1、CHOP 和caspase 12蛋白表达量。

表1 各组大鼠于CPR后1h、24h与sham组海马ERS标记物mRNA含量比较(μg)

表2 各组大鼠于CPR后1h、24h与sham组海马ERS标记物蛋白含量比较(μg/L)

观察指标：数据应用GraphPad Prism 5.0 软件处理；所有计量数据以Mean±SEM 表示，正态分布的数据采用单因素方差分析，组间比较采用Student-Newman-Keuls 检验，非正态分布数据采用Mann-Whitney U 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

各组实施CRP 后海马ERS 标记物以及mRNA 含量比较：GRP 78、XBP-1 信使RNA含量在CRP后持续增加，GRP 78在24 h后达到峰值，含量是sham组(本次研究中sham组是假手术组，目的在于作为对照，从而进一步说明研究结果的科学性。)的2倍，XBP-1信使RNA是sham的1.67 倍，CHOP 和caspase 12 信使RNA则增加量和GRP 78、XBP-1 相比较为缓慢。而CPR 后24 h，CHOP 和caspase 12分别增加1.91 倍和1.62 倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

各组实施CRP 后海马ERS 标记物蛋白质比较：在GAPSH 表达一致的情况下，在和sham 组比较后，GRP78、XBP-1、CHOP、caspase 12 均 为 增 加量，其中CRP 进行3 h 后，GRP78、XBP-1 增加较为明显，CHOP、caspase 12则在6 h，sham组相比，在CRP后24 h，GRP78、XBP-1、CHOP、caspase 12分别增加1.58 倍、1.76 倍、2.13 倍、2.51 倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

讨 论

在CRP 完成后导致脑损伤的生理功能十分复杂，过量氧自由基及氨基酸毒性损伤，病理性蛋白质和细胞内凋亡信号激活，是导致脑部损伤的主要原因。因此全身系统综合管理具有非常重要的作用和意义，但目前虽然新药层出不穷，但疗效显著的治疗方式仍屈指可数[2-3]。所以需要采取新的研究方向，找到新的信号通路以及药物对CPR进行改善，并对神经功能障碍方面进行的脑复苏领域作为重点研究项目。人们已经逐步发现，ERS 反应和相关信号的传导机制与细胞凋亡关系密切，因此内质网应激是细胞的保护机制，且ERS 厚内质网会出现大量没有折叠的蛋白，随时间持续，未折叠蛋白会大量聚集，使内质网功能受到影响，细胞凋亡。大量没有折叠的蛋白质会引发各种系统功能障碍[4-5]。在本次研究中，在CRP 后24 h，GRP78、XBP-1、CHOP、caspase 12 分 别 增 加1.58倍、1.76倍、2.13倍、2.51倍，差异有统计学意义(P＜0.05)，和周东民等[6]人研究结果一致。

综上所述，内质网应激和CRP 后脑损伤之间关系密切，但需要进一步进行研究。