血清lncRNA UBE2CP3在肝细胞癌筛查中的应用价值

林金端,尹卫国,刘艳枚,杨梦,禤淑霞,成彬,陈晨,周鹏,刘红伟(清远市人民医院.分子诊断中心，.输血科，广东清远 511500)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)具有恶性程度高，易发生转移、预后差等特点，严重威胁人类健康。早发现、早治疗是提高HCC患者预后的有效手段。长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是近年来发现的具有多种调控功能的RNA转录本，参与了肿瘤的发生、发展调控，部分lncRNA可在血清中被检测到，且能稳定存在。鉴于血清核酸检测的简便性和快速性，血清中特异性表达的lncRNA有望成为诊断HCC的新一代生物学标志物。泛素结合酶E2C(UBE2C)假基因3(UBE2CP3)定位于4号染色体。本课题组前期研究时通过lncRNA表达谱基因芯片检测发现UBE2CP3在肝癌组织中呈高表达，后续研究相继发现lncRNA UBE2CP3与肝癌的上皮-间质转化(EMT)、血管生成密切相关[1-2]。鉴于EMT、血管生成过程与肝癌生长、转移密切相关，本研究拟通过分析HCC患者、HCC转移患者与健康人对照组血清UBE2CP3的表达水平，探讨其潜在的临床意义。

1 研究对象与方法

1.1研究对象 收集2017年11月至2019年1月于清远市人民医院肝胆外科就诊的原发性HCC患者115例，男100例，女15例，年龄27～88岁，中位年龄56岁。纳入标准：依据美国肝病研究学会(AASLD)指南[3]，对于直径>1 cm的结节,经增强CT或MRI之中至少1种影像检查结果显示为“快进快出”者，且均经病理组织学明确诊断，术前未行化疗、放疗。排除标准：排除心肾功能异常、其他恶性肿瘤、继发性肝癌。其中92例未发现肝内外转移，23例发生肝脏内多发性转移或其他部位转移。收集同期在本院体检中心体检健康者79例作为健康人对照组，男69例，女10例，年龄22～87岁，中位年龄55岁，肝癌组与健康人对照组年龄(Z=0.32，P=0.75)、性别(χ2=0.006 2，P=0.94)差异均无统计学意义。本研究经清远市人民医院医学伦理委员会批准(No:QPH-IRB-A0115)，患者均知情同意。

1.2仪器与试剂 血清RNA提取试剂盒(广州美基生物科技公司)，M-MLV逆转录酶(北京普洛麦格生物技术公司)，TaKaRa逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒(大连宝生物科技公司)。ABI 7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，NANO DROP 2000 超微量紫外可见分光光度仪(赛默飞世尔科技公司)。

1.3标本采集 使用干燥真空管采集经影像学诊断为肝脏占位HCC患者治疗前(体检健康者于体检时采集)的空腹静脉血2～3 mL，另收集18例接受HCC根治术的患者术前以及术后30 d的空腹静脉血2～3 mL，2 500 r/min离心5 min，收集血清，置于-20 ℃保存，根据患者术后病理诊断结果及排除标准确定样本是否入组。

1.4血清总RNA提取 采用柱提法，按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书提取血清样本总RNA，采用NANO DROP 2000 超微量紫外可见分光光度仪检测RNA纯度，取吸光度(A260/280 nm)约为2.0的样本用于后续试验。

1.5实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 根据GenBank中UBE2CP3(基因序列号：100129983)及U6(基因序列号：26827)的序列，由和元生物科技公司设计并合成引物。UBE2CP3上游引物序列：5′-AAGTGGTCTGCCCTGTATGATG-3′，下游引物序列：5′-GAGCTATCAATGTTGGGTTTGC-3′；U6上游引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。 PCR总反应体系为20 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，SYBR premix EXTaq 10 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，模板DNA 2 μL，无菌ddH2O补足体积至20 μL。反应参数:95 ℃预变性2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，共40个循环；72 ℃ 5 min。结果以2-△△Ct法表示。

2 结果

2.1各组UBE2CP3表达水平的比较 qRT-PCR检测结果表明，血清中UBE2CP3的表达水平在健康人对照组(12.90±4.96)、HCC未转移组(17.39±3.11)、HCC转移组(22.54±3.96)中呈逐步升高趋势，差异具有统计学意义(F=59.23,P<0.01)，进一步经LSD-t检验结果表明，健康人对照组与HCC未转移组(t=7.23，P<0.01)，健康人对照组与HCC转移组(t=10.12，P<0.01)，HCC未转移组与HCC转移组(t=5.61，P<0.01)间差异均具有统计学意义。

2.2ROC曲线分析UBE2CP3诊断HCC的筛查效能 以病理诊断为金标准，将健康人对照组、HCC组检测UBE2CP3的相对表达量纳入ROC曲线分析，评估UBE2CP3筛查HCC的效能，结果显示ROC曲线面积(AUCROC)为0.794， 95%CI为0.728～0.859，当cut-off值为14.035时，其敏感性为56.96%，特异性为90.35%(图2)。

2.3手术前后HCC患者血清UBE2CP3表达水平的改变 18例HCC患者术前血清UBE2CP3表达水平为18.04±2.46，术后30 d为17.40±2.42，两组间差异具有统计学意义(t=3.934，P<0.01)。

3 讨论

HCC是肝脏最常见的肿瘤之一，严重威胁人类健康。研究表明，早期无症状小肝癌患者手术效果好，但HCC患者早期临床症状不明显，因缺乏有效的早期诊断指标，极易错过手术治疗最佳时机，其5年生存率较低[4]。因此，寻求可用于HCC诊断和病程监测的生物学标志物对提高HCC患者生活质量和预后具有重要的意义。UBE2CP3是本课题组前期通过lncRNA基因芯片差异表达谱分析时发现的在HCC组织中呈高表达的lncRNA[2]。lncRNA是一类不编码蛋白质的转录本，广泛参与基因组转录前水平、转录水平和转录后水平多层次的调控，影响生物体的多项功能，其表达水平失衡与多种疾病相关。大量数据表明，lncRNA与HCC的发生、发展密切相关[5-7]；另外，lncRNA也被发现存在于血液循环中，血液循环中lncRNA表达水平的变化与HCC的病程进展有着密切的关系[8-10]。因此，血清中lncRNA有望成为新一代HCC诊断的生物学标志物。本研究中，HCC患者血清UBE2CP3的表达水平明显高于健康人对照组，且在转移组中呈明显升高趋势，提示血清UBE2CP3的表达水平与HCC转移过程相关，与我们前期关于UBE2CP3的功能机制研究结果相吻合[1-2]。UBE2CP3与肝癌细胞的侵袭、迁移、管腔形成等生物学功能相关，当肝细胞发生癌变时，肝癌细胞内UBE2CP3的表达水平升高，并释放入血。因此，血清中UBE2CP3的表达水平在一定程度上反映了HCC组织UBE2CP3的表达水平。本研究进一步对18例接受HCC根治术治疗的患者术后30 d血清UBE2CP3表达水平进行检测，结果发现HCC患者接受手术后其UBE2CP3表达水平呈下降趋势，提示血清中的UBE2CP3来源于HCC组织，手术切除HCC组织后，释放入血的UBE2CP3减少或消失，而原来血清中存在的UBE2CP3经代谢或排泄，从而呈现下降现象。术后出现UBE2CP3下降并维持较低水平提示手术效果良好，术后监测血清UBE2CP3的表达水平可用于HCC根治术效果和预后的监测。

综上所述，UBE2CP3参与HCC发生、发展过程，血清中UBE2CP3表达水平与HCC进展相关，后续研究中我们将进行大样本数据验证，UBE2CP3有望成为HCC诊断和疗效监测的新型生物学标志物。