新型冠状病毒刺突糖蛋白氨基酸序列特征分析

杨春伟，孙海燕，崔大伟，丁伟(1.浙江大学医学院附属第一医院a.病理科，b.输血科，杭州310003；.绍兴第二医院检验科，浙江绍兴31000)

新型冠状病毒又称为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，导致人类严重呼吸综合征(称为COVID-19)[1-3]。根据WHO疫情通报显示：截止2020年3月31日，我国累计确认82 554病例，死亡3 314例，全球205个国家发生确认病例，累计确认750 890例，死亡57 610例(https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/

20200331-sitrep-71-covid-19.pdf?sfvrsn=4360e92b_8)。SARS-CoV-2与SARS-CoV的基因组同源性约为80%，与蝙蝠冠状病毒(SARS-CoV-RaTG13)的同源性约为96%[4-6]。冠状病毒表面的刺突糖蛋白(spike glycoprotein, S)通过其受体结构域(RBD)识别并结合宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，在介导病毒包膜与细胞膜融合导致细胞感染的过程中发挥关键作用，这使S蛋白成为中和抗体和疫苗的主要抗原靶点[6-8]。S蛋白的变异严重影响SARS-CoV-2对宿主的感染，因此探讨S蛋白的变异情况将有助于SARS-CoV-2流行的控制。

1 资料与方法

1.1资料 从全球共享禽流感数据库(GISAID)和GenBank数据库收集2019年12月至2020年3月27日中国大陆255株SARS-CoV-2的S蛋白基因序列，同时下载SARS-CoV、MERS、蝙蝠冠状病毒和穿山甲感染的冠状病毒序列共12个，作为参考株：Human SARS coronavirus BJ01-2003(AY278488.2)、Human SARS coronavirus GZ02-2003(AY390556.1)、MERS coronavirus(NC-019843.3)-2012、bat-SL-CoVZC45-2018(MG772933.1)、bat-SL-CoVZXC21-2018(MG772934.1)、bat-coronavirus-RaTG13-2020(MN996532.1)、hCoV-19/pangolin/Guangxi/P5L/2017/EPI-ISL-410540、hCoV-19/pangolin/Guangxi/P5E/2017/EPI-ISL-410541、hCoV-19/pangolin/Guangxi/P4L/2017/EPI-ISL-410538、hCoV-19/pangolin/Guangxi/P2V/2017/EPI-ISL-410542、hCoV-19/pangolin/Guangxi/P1E/2017/EPI-ISL-410539、hCoV-19/pangolin/Guangdong/1/2019/EPI-ISL-410721。

1.2方法 利用MEGA 6.0分子进化遗传分析软件，用邻接法(Neighbour-Jioning, N-J)对下载的冠状病毒S氨基酸序列构建氨基酸种系分子进化树，自展值(Bootstrap)设置为1 000，同时对S氨基酸序列的分子变异特征进行分析。

2 结果

2.1S糖蛋白同源性和种系进化分析 中国大陆SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸系统进化树分析显示：从GISAID和GenBank数据库收集的255株SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列相互间差异较小，处于同一分支，其同源性为96.8%～100%。其中，hCoV-19/Shanghai/SH0104/2020/EPI-ISL-416395与其余254株SARS-CoV-2的S蛋白序列的氨基酸同源性仅为89.9%～93.7%；12株参考株S蛋白氨基酸序列的差异较大，同源性为34.1%～99.9%，其中MERS coronavirus(NC-019843.3)与其他11株的同源性最差，为34.1%～39.1%；12株参考株中，bat-coronavirus-RaTG13(MN996532.1)的S蛋白序列与255株SARS-CoV-2的氨基酸同源性最近，为86.6%～93.4%，而bat-SL-CoVZC45(MG772933.1)和bat-SL-CoVZXC21(MG772934.1)与255株SARS-CoV-2的S蛋白同源性分别为70.3%～75.6%和69.6%～75.1%；MERS coronavirus(NC-019843.3)与255株SARS-CoV-2的氨基酸同源性最远(34.9%～39.1%)；2株Human SARS coronavirus BJ01和Human SARS coronavirus GZ02，与255株SARS-CoV-2的S蛋白同源性均为66.2%～71.8%；6株穿山甲感染的冠状病毒与255株SARS-CoV-2的S蛋白同源性为76.9%～84.8%。见图1。

2.2S糖蛋白氨基酸位点变异分析 255株SARS-CoV-2病毒S蛋白的关键位点L455、F486、Q493、S494、N501和Y505均未发生变异，且S蛋白RBD受体结合域关键位点N439，V483和Q493也均未发生变异；255株SARS-CoV-2病毒S蛋白的变异情况如下：5株发生H49Y突变，3株为D614G突变，2株为M153T突变，2株为V1040F突变，2株为I1216T突变，Y28D/N突变各1株等。此外，在255株病毒的RBD(306～543aa)域中，仅有hCoV-19/Shenzhen/SZTH-004/2020/EPIISL406595发生N354D和D364Y突变，hCoV-19/Shanghai/SH0017/2020/EPIISL416328发生S359N突变，hCoV-19/Shanghai/SH0007/2020/EPIISL416320发生K378R突变， hCoV-19/Guangdong/GD2020087-P0008/2020/EPIISL413863发生Q409E突变。见表1。

表1SARS-CoV-2病毒S蛋白氨基酸变异分析

3 讨论

冠状病毒科(CoV)是已知的最大的单股正链RNA病毒，根据血清学与基因组的结构特点，冠状病毒通常被分为α、β、γ和δ 4个属，SARS、SARS-CoV-2和MERS均属于β-CoV属[4-5]。目前，对于SARS-CoV-2感染人群的治疗，除了有效隔离和常规的对症治疗以外，特效药物和疫苗的研发仍在进行中。SARS-CoV-2的基因特征特别是S蛋白的分子特征对于药物和疫苗的研发至关重要[6-7]。本研究从GISAID和GenBank数据库下载255条SARS-CoV-2的S蛋白序列，其由1 273个氨基酸组成。通过系统发育树显示发现，255株SARS-CoV-2的S蛋白处于同一分支，且同源性为96.8%～100%，表明中国大陆SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列高度同源，相互间变异较小，与近期的研究结果相似[9-11]。初步表明在我国流行的SARS-CoV-2 S蛋白序列并未发生明显变异。进一步分析显示，255株SARS-CoV-2的S蛋白序列与参考株之间存在一定差异，与bat-coronavirus-RaTG13 (MN996532.1)的S蛋白序列的氨基酸同源性最近且高达93.4%，与近期的研究结果相一致[10-13]。

研究表明，SARS-CoV-2通过S蛋白受体结构域RBD与宿主细胞表面受体结合，介导病毒包膜与细胞膜融合，促进病毒的侵入，而RBD域是SARS及其相关冠状病毒基因组种最容易变异的区域，特别是关键氨基酸对与人体ACE2受体结合及确定宿主类型至关重要[6-8]。本研究显示，S蛋白的关键位点L455、F486、Q493、S494、N501和Y505均未发生变异，且S蛋白RBD受体结合域中的关键位点N439、V483和Q493也均未发生变异，提示SARS-CoV-2容易通过RBD域与人体ACE2结合，导致病毒的感染与流行，这与之前报道的结果相一致[10-11]。此外，我们的研究还发现，S蛋白中某些位点氨基酸发生变异，如5株发生H49Y突变，3株为D614G突变等，重要的是部分SARS-CoV-2的S蛋白区RBD域发生变异(如N354D、D364Y、S359N、K378R和Q409E)，但这些变异是否影响S蛋白及RBD域的结构和功能仍需进一步深入研究。

总之，本研究初步探讨了在我国暴发流行的SARS-CoV-2病毒S蛋白区的分子特征，显示该病毒的S蛋白并未发生明显的变异，这为针对SARS-CoV-2病毒的药物研发、特异性抗体的制备及疫苗的设计提供参考依据，且S蛋白区分子特征的持续监测有助于SARS-CoV-2病毒的预防和控制。