浅谈无细胞蛋白质合成系统的分类和应用

陈绍华

摘 要 无细胞蛋白质合成（CFPS）是一种技术平台，为蛋白质表达、代谢工程、治疗发展、教育等提供了新的机会。CFPS相对于体内蛋白质表达的优势包括其开放的系统，消除对活细胞的依赖，以及将所有系统能量集中在生产感兴趣的蛋白质上的能力。在过去的60年里，CFPS平台已经大大发展和多样化，并会继续发展。当前发展领域的新应用和新类型都是基于多种生物提取物。本文主要介绍高采纳平台的应用，从应用的角度来阐明这些平台的差异。

关键词 无细胞蛋白合成（CFPS）;体外转录-翻译（TX-TL）;无细胞蛋白表达（CFPE）;体外蛋白质合成;无细胞合成生物学

引言

蛋白质作为重要的生物大分子，是所有生物体维持结构、功能的必需物质[1]。无细胞蛋白质合成（Cell-free Protein Synthesis，CFPS）大约在60年前出现，作为一个平台，被尼伦伯格和马特海伊用来破译遗传密码，并发现mRNA与蛋白质合成之间的联系。自这一发现以来，CFPS平台已经成长为各种应用，从功能基因组学到大规模抗体生产。

目前，CFPS已经使用来自许多不同生物体的细胞提取物来实现，其独特的生物化学特性使其能够广泛应用。对CFPS日益增长的兴趣是与平台开放性质相关的关键优势的结果。CFPS反应缺乏细胞膜和功能基因组，因此不受细胞生命目标的限制。因此，当试图在体内产生大量重组蛋白时，细胞所承受的代谢和细胞毒性负担在CFPS中是被避免了，可以直接操纵蛋白质生产环境，因为它是一个开放的系统。在某些情况下，使用CFPS可以获得更高的蛋白质滴度，因为系统中的所有能量都被引导到生产感兴趣的蛋白质中去。无细胞蛋白质合成系统已成为十分重要的蛋白质合成系统，在大规模表达重组药物、制备蛋白质芯片等方面具有巨大的潜力。

1CFPS反应模式

作为一个开放和高度个性化的平台，CFPS反应可以以多种格式执行，包括耦合、非耦合、批处理、连续流动、连续交换、冻干， 或微流控格式，这取决于用户的需要。

除了基于细胞提取的CFPS试剂盒外，PURE 表达试剂盒包括重组大肠杆菌转录和翻译机制的纯化成分。 PURE（protein synthesis using recombinant elements）利用单独纯化的组分代替细胞提取物，其中包括10个翻译因子：T7RNA聚合酶、20个氨基酰基-tRNA合成酶、核糖体、焦磷酸酶、肌酸激酶、肌激酶和核苷二磷酸激酶。该系统需要过表达和纯化每个成分，但得益于没有蛋白酶和核酸酶以及系统的确定性质，总的来说PURE系统比均质的细胞提取CFPS允许高纯度和稍微容易操作的反应条件。然而，这些试剂盒相对自己生产和商业上可用的基于提取物的CFPS是十分昂贵的（$0.99/?L反应物），其生产力（～100?g/mL）也明显低于它们的基于大肠杆菌提取物的CFPS對应物。

2无细胞蛋白合成的应用

2.1 平台分类的介绍

在无细胞蛋白质合成出现的60年中，已经开发了许多基于各种生物的细胞提取物平台。 包括细菌、植物、哺乳动物和人类细胞系的提取物。每个产生的平台由于给定生物物种的独特生物化学特性，而在易于制备、蛋白质产量和可能的应用中都有不同的结果。 本文中将这些不同的平台分为两类：高采纳平台和低采纳平台。

2.2 高采纳平台

高采纳包括基于大肠杆菌、昆虫、酵母、中国仓鼠卵巢、兔网织红细胞裂解液、小麦胚芽和HeLa细胞的平台。这些平台已被用于各种应用并在CFPS领域确立可用性和多功能性方面经受了时间的考验。

（1）教育

CFPS系统的开放性质和由此产生的直接操纵细胞机器为基于探究的学习提供机会，这点使CFPS特别适合于教室。CFPS技术在教育中的第一个应用是BioBits套件，它对不同年龄的学生进行了测试。这些套件提供了多功能的实验选择并且相对便宜（一个班级大约$100）。Bio Bits Bright和Explorer工具包代表了可以启用CFPS的课堂实验和应用程序的多样性，荧光蛋白的产生，水凝胶的产生以及水果DNA的鉴定。这些可能性表明，CFPS可以提供一种动手的方式来探究性地学习生物化学概念。

（2）翻译后修饰（PTMs）

翻译后修饰（PTMs）可以极大地影响蛋白质的折叠、活性和稳定性，这可能是治疗蛋白、膜蛋白和病毒样颗粒所必需的。因此在选择CFPS平台时，在感兴趣的蛋白质中进行各种翻译后修饰（PTMs）的能力是一个关键的考虑因素。具有内源性微粒体的平台显示出更大的支持PTM能力。这使得像中国仓鼠卵巢、HeLa和昆虫这样的平台很适合这种应用，因为内源性微粒体是由内质网形成的，并在这些提取物的制备过程中得到保留。然而，当利用内源性微粒体时，就在系统中引入了一个新的“黑盒”，限制了用户的控制，并将PTMs的选择限制在那些固有细胞系中。

一些PTMs可以在大肠杆菌CFPS中实现，但由于缺乏内源性微粒体和在杆菌中可能的PTMs数量有限，使这种应用与真核生物相比通常在技术上更具挑战性。然而，大肠杆菌的利用在总体蛋白质产量和提取物制备方便方面仍然是有利的，这促使了PTMs在这个平台上的发展。 反应的开放性使用户能够调整氧化还原条件，使二硫键的形成在该平台可行。

（3）高通量筛选

实现高通量蛋白质生产的能力是CFPS的一个主要优势，因为它使快速生产和筛选各种蛋白质产品的速度远远快于体内蛋白表达模式。耦联CFPS允许直接插入DNA模板，而不需要细胞转化/转染，在某些情况下可以不做纯化直接进行蛋白质产品的检测，创造一个强大的一锅系统。高通量CFPS的一个关键应用是功能基因组学，它允许阐明新的基因及其相应的蛋白质功能。高通量筛选可以在任何平台上进行，但最常见的是利用大肠杆菌、小麦胚芽和兔网织红细胞提取物。

（4）病毒样粒子

病毒样粒子（VLPs）是缺乏基因组物质的病毒的衣壳，这意味着它们是一个高度组织和对称的蛋白质聚集体，能够在其中携带感兴趣的分子。因此，VLPs的生产允许研究病毒组装，创建有效的疫苗，使用封装输送药物以及材料科学方面的应用。虽然VLPs可以在体内产生，但在CFPS平台上的生产提供了优势，包括合成有毒的VLPs和操纵反应的氧化还原条件形成热力学稳定所必需的合适的二硫键。CFPS反应的多功能性还允许一个能够生产许多类型VLPs的单一的、更强的平台，在一个比体内条件下可伸缩的更高产量和更容易修改的反应设置平台来实现。

（5）大规模生产

实现CFPS的演示从高通量规模的到制造规模扩大了该平台的效用。 有兴趣利用这个应用能力的用户用CFPS生产抗体和工业酶等，以及将CFPS工具包用于现场或教育用途，这些用户应考虑在整个流程中扩大其规模的技术细节。这首先是细胞生长的能力，以及规模化提取物的制备，能够实现这种规模的平台包括大肠杆菌、小麦胚芽兔网织红细胞。

（6）膜蛋白

膜蛋白的研究是蛋白质组学的一个重要组成部分，因为它们在生物体中具有很高的丰度。大约25%的测序基因编码把自己整合到细胞膜上的输水蛋白。膜蛋白在细胞内有很多功能，包括细胞识别、免疫应答、信号转导和分子转运。但是在体内以正确的构象表达这些完整的蛋白质往往是一个挑战，因为在表达过程中自然丰度低，疏水性高，必须转运到膜上，这会影响宿主细胞膜的完整性。

CFPS平台能够通过非膜结合系统避免依赖细胞膜的结构完整性来规避这些挑战。此外，在提取物制备过程中，微粒体、囊泡状结构或内质网片段（内源性微粒体）的存在允许膜蛋白正确折叠和结合，在蛋白质合成过程中蛋白质本身进入这些结构。也就是说HeLa、中国仓鼠卵巢和昆虫平台都含有内源性微粒体它是在由提取物制备过程中的内质网破裂形成的。这些平台已经成功地表达了许多膜蛋白，从双跨膜疟疾蛋白（HeLa）到表皮生长因子受体蛋白质（中国仓鼠卵巢），最后到KcsA钾离子通道（昆虫）。

（7）抗体

利用CFPS在体外生产功能性抗体和抗体片段具有简化抗体生产过程以更快速制造的潜力。这个优点部分是由于系统开放，它可以很容易地应用快速设计-构建-测试循环和修改氧化还原潜力，从案例到案例地进行修改以生产活性抗体。家兔网织红细胞、大肠杆菌、中国仓鼠卵巢、小麦胚芽和昆虫平台都已经能产生抗体。

2.3 低采纳平台

迄今为止，低应用程度的无细胞平台包括来自粗糙链孢霉、链霉菌、纳氏弧菌、枯草芽孢杆菌、烟草、拟南芥、假单胞菌、大芽孢杆菌，古细菌和利什曼原虫的平台。这些平台被定性为低采纳平台，因为每个平台发表的论文少于25篇。

对该平台进行优化的目的是用于表达高GC含量模板，以便在体外生产天然基因簇。随着新的基因組挖掘技术，对天然产物基因簇的认识正在迅速增加。然而，在体内表达这些簇会导致非常低的可溶性产量，因为其对细胞有代谢负担。基于链霉菌的CFPS不仅为更高GC含量模板的密码子优化提供了一个机会，也为天然产物基因簇的可溶性表达提供了一个机会。

3结束语

高采纳已经得到了最好的优化，并且有丰富的文献来支持。高采纳平台包括大肠杆菌、昆虫、酵母、中国仓鼠卵巢细胞、兔网织红细胞，小麦胚芽，和海拉细胞。它的应用包括教育、翻译后修饰、高通量表达、类病毒粒子生产、大规模合成、膜蛋白以及难以合成的蛋白质（抗体、大蛋白、冰结构蛋白和金属蛋白），以及其他各种应用（翻译机制、遗传密码扩展、代谢工程和遗传线路的研究等）。本文还简要介绍了低采纳平台所启用的应用，包括链霉菌等。虽然这些平台有一些工作支持它们的使用，但它们通常只被少数人使用，没有经过很多优化。如果对这些平台做更多的工作，仍然可能为该领域提供一些关键优势。

参考文献

[1] 高伟，卜宁，卢元.无细胞体系非天然蛋白质合成研究进展[J].生物工程学报，2018，34（9）：1371-1385.

[2] 张米，赵国琰，戴美学.无细胞蛋白质合成系统的研究进展及应用前景[J].生命科学，2018，30（1）：94-99.