施用有机肥提高黑土土壤酶活性、增加细菌数量及种类多样性

徐忠山，刘景辉，逯晓萍，陈晓晶，张博文，张兴隆，周 祎，杨彦明

（内蒙古农业大学农学院，内蒙古 呼和浩特 010019）

东北黑土区是我国重要的粮食生产基地［1］，但由于缺乏用养结合的保护意识及不平衡的培肥措施等原因导致土壤退化问题逐渐凸显［2］。土壤微生物群落在调控生态系统养分循环、土壤结构的改良与优化方面发挥着重要作用［3］。土壤微生物数量及其多样性和土壤酶活性，对土壤有机质分解和养分转化十分重要，是评价土壤质量和生态系统健康的重要指标［4-5］，对各种农业管理措施如施肥及耕作方式等变化较敏感［6-9］。Bastida 等［10］发现有机肥中含有大量酶，对土壤酶有增加的作用。Zhang等［11］的研究得出，施入有机物料改变了土壤微生物菌落结构，提高了细菌的丰度。Saison 等［12］研究表明施用有机肥可改变土壤微生物群落的活性、数量和组成。白震等［13］研究认为土壤类型对微生物数量的影响起主导作用，施用有机肥短时间内可改变土壤微生物的数量。也有研究发现不同施肥影响了土壤细菌相对丰度［14］，施有机肥或有机无机配施可以提高土壤多种酶的活性［15-16］。然而关于施用有机肥对土壤微生物群落及酶活性的研究并没有一致的结论。

开展土壤微生物相关研究，有利于维护与改良土壤生态系统功能［17］。目前关于有机肥施用量对黑土土壤酶活性及微生物群落相关研究鲜有报道。本文以兴安盟扎赉特旗典型黑土为研究对象，结合 16S rRNA 和高通量测序技术，探讨不同有机肥施用量对黑土细菌多样性、群落结构及过氧化氢酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶和脲酶活性的影响，以探索土壤细菌群落组成变化规律及其与土壤酶活性的关系，为黑土区科学施用有机肥提供依据，为揭示我国黑土群落生态功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本试验于2016 ～2017 年在内蒙古兴安盟扎赉特旗农业科技示范园区开展，该地区属温带大陆性半干旱季风气候区，年均日照为2 855 h，常年积温2 600℃左右。无霜期110 ～135 d，土壤类型为黑土。试验地养分状况见表1，试验期间降水量和气温变化见图1。

表1 试验地养分状况（0 ～20 cm）

图1 试验期间降水量和气温变化

1.2 试验设计

本试验设不施有机肥处理（CK）、有机肥施用量15 000（YJ1）、22 500（YJ2）、30 000（YJ3）、37 500（YJ4）和45 000 kg/hm2（YJ5）6个处理，各小区采用随机区组设计，重复3 次，小区面积13.2 m×10 m=132 m2。2016、2017 年播前25 d，将有机肥均匀施入各小区，随即进行深翻、旋耕。两年均为5 月10 日播种，玉米品种为恒育498，播种机播种，播量22.5 kg/hm2，行距65 cm，株距25 cm，保苗数60 000 株/hm2。机施尿素150 kg/hm2、磷酸二铵225 kg/hm2，不追肥。于5 月26日、7 月12 日灌水2 次，灌水量900 m3/hm2，10 月10 日收获。

1.3 样品采集与分析

于2016、2017 年10 月玉米收获后每小区按“S”型取样法取0 ～20 cm 土壤样品，6 个点混合为一个样品，每个处理重复3 次。土样装入无菌密封袋，后置于保温箱带回实验室，立即测定土壤生物学性质。土壤过氧化氢酶活性采用微量滴定法测定［18］；蔗糖酶采用二硝基水杨酸比色法测定［18］；碱性磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定［18］；土壤脲酶采用靛酚蓝比色法测定［19］。2016 年土壤样品测定土壤微生物群落，方法参照方伟［20］的研究。

1.4 数据处理分析

测序数据处理以及OTU 聚类和物种注释方法参照方伟［20］的研究。使用Qiime 软件（Version 1.7.0）计算样品复杂度，并进行多样品比较分析。分别使用R 软件（Version 2.15.3）绘制PCoA 图和稀释曲线。试验中数据采用 Excel 2003 和 SAS 9.0软件进行统计分析。图表数据均是平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 施用有机肥对土壤酶活性的影响

由 图2 可 知，2016 与2017 年 施 用 有 机 肥 明显提高了4 种酶活性，2016 年蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶与碱性磷酸酶活性较CK 分别提高了26.3% ～56.6%、5.8% ～56.4%、0% ～17.7%和7.4%～43.6%，YJ2 处理酶活性较高；2017 年各处理土壤酶活性表现与2016 年基本一致。各处理4种酶活性明显高于CK，且随着有机肥施用量的增加，土壤酶活性总体上呈先升后降趋势，当施用量达到15 000 kg/hm2时，2017 年过氧化氢酶活性达到最大值，其它在施用量22 500 kg/hm2时达最大值，继续增加施用量，土壤酶活性下降。由于2017 年的高温及降水影响，与2016 年相比，过氧化氢酶活性显著提高，其他3 种酶活性则显著降低。水分代谢是土壤微生物等活动的基础，水分不足，微生物活性受到抑制，进而酶活性受影响。

2.2 各处理测序深度及多样性指数的差异

由表2 可知，各处理的土样OTU 数量在3 681 ～3 942 之间，施用有机肥各处理OTU 数量均高于CK，表明有机肥施入土壤提高了细菌多样性，且整体表现为施入量越多，细菌多样性越高。所有处理测序深度指数均达到99%。由表2 可知，施用有机肥各处理ACE 和Chao1 数值均高于CK，但未达到显著水平（P＜0.05）。表明施用有机肥提高了土壤细菌丰富度，且土壤细菌丰富度与还田量呈正相关关系。各处理香农和辛普森指数值差异显著，YJ1、YJ2 和YJ3 处理香农指数均低于CK，YJ4 和YJ5 处理则高于CK；YJ1、YJ2 处理辛普森指数均低于CK，YJ4 处理高于CK，YJ3、YJ5 处理与CK 相同。表明不同有机肥施用量对土壤细菌群落多样性影响具有差异。ACE 指数、Chao1 指数、香农指数和辛普森指数均为YJ4 处理最高，表明该施用量下，土壤中细菌群落物种数量最多，且群落多样性和均匀度高。

图2 2016 ～2017 年各处理土壤酶活性变化

表2 16S r RNA 基因 OTU 数、丰富度和多样性指数

根据细菌 16S rRNA 测序的稀释性曲线（图3A），当测序量超过60 000 条时，整个曲线已经趋于平缓，同样说明该测序文库已经达到饱和。花瓣图可以直观地表现6 个处理土壤细菌群落的OTU 数目组成相似性、重叠情况以及特异性（图3B）。6 个处理存在共有细菌 OTU 数量为3 190，CK、YJ1、YJ2、YJ3、YJ4 与YJ5 处理的特异性细菌OTU 数 量 分 别 为145、141、133、147、138 和158，YJ5 处理特异性细菌OTU 数量最多。

由图4 可知，各处理的3 个重复距离较接近，表示同一处理的样品群落结构相似度较高，组间差异大于组内差异，各处理土壤细菌群落结构差异显著。各处理可被PC1 区分为两组，CK、YJ1、YJ4处理分布在右侧方，YJ2、YJ3 处理分布在左侧方，说明CK、YJ1 和YJ4 处理、YJ2 和YJ3 处理的细菌群落结构聚集程度最接近。

2.3 施用有机肥对细菌群落构成的影响

由图5 可知，各处理土壤细菌群落中，相对丰度最高的菌门为变形菌门（Proteobacteria），占38.5%～46.2%，随后依次是放线菌门（Actinobacteria）21.9%～32.4%、酸杆菌门（Acidobacteria）6.8%～11.6%、拟杆菌门（Bacteroidetes）4.3%～7.6%、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）2.9% ～4.0%、绿弯菌门（Chloroflexi）2.5% ～4.0%、厚壁 菌 门（Firmicutes）1.1% ～2.8%、 浮 霉 菌 门（Planctomycetes）1.2%～2.9%、疣微菌门（Verrucomicrobia）1.0%～1.5%、绿菌门（Ignavibacteriae）0.2%～0.8%和其他3.3%～4.2%。

图3 土壤细菌群落高通量测序文库稀释曲线及OTU 花瓣图

图4 基于Weighted Unifrac 距离的主坐标分析

图5 门水平上最大丰度排名前10 的物种相对丰度柱形图

除YJ4 处理施用有机肥各处理变形菌门的相对丰度显著高于CK，YJ2 处理丰度最高。变形菌门包括丰富的固氮细菌，有机肥还田可提高土壤固氮能力。放线菌门多为致病细菌，施用有机肥各处理放线菌门相对丰度显著低于CK 及YJ4 处理。施用有机肥处理厚壁菌门相对丰度均明显高于CK，可以更好地分解土壤养分，同时提高土壤抵御外来病原体能力。

2.4 施用有机肥影响土壤细菌菌群结构的因子分析

图6 的RDA 分析表明，两个主要轴特征值分别为51.73%和19.50%；两个轴相关系数为0，RDA 分析结果可信［21］。不同有机肥施用量细菌群落变化差异明显，YJ2 与YJ3 处理在第一排序轴的正端，其他4 个处理在序轴负端；CK、YJ1、YJ3与YJ4 处理在第二排序轴的正端，而YJ2 与YJ5处理在序轴负端。第一轴排序与脲酶（相关系数为0.865）、过氧化氢酶（0.695）、蔗糖酶（0.649）呈正相关，与碱性磷酸酶无明显相关性；第二轴排序与过氧化氢酶（0.719）呈正相关，与蔗糖酶（0.761）和碱性磷酸酶（0.999）呈负相关，而与脲酶无明显相关性。结果表明，过氧化氢酶和蔗糖酶活性是影响细菌群落多样性较大的因子。

图6 不同处理土壤生物学性质与细菌群落（门水平）的冗余分析

3 讨论

3.1 施用有机肥对土壤酶活性的影响

土壤酶活性受土壤微环境的影响，能有效反映出土壤的质量和健康状况［7，22］，轻微的环境改变会使土壤中酶活性发生变化。前人研究表明，施入有机肥可提高土壤蔗糖酶、脲酶和磷酸酶以及过氧化氢酶活性［21-22］。王飞等［23］研究结果与上述具有一定差异，其研究表明，长期施有机肥处理土壤过氧化氢酶活性低于不施肥处理。本试验中，有机肥还田土壤4 种酶活性均显著高于CK，YJ2 处理增幅最大，2016 与2017 年规律基本一致。其原因可能是有机肥含有大量植物残体及微生物，微生物数量及其代谢活动所需的底物数量提高，促进微生物产生了更多的土壤酶。本研究结果进一步表明，2017 年各处理土壤脲酶、蔗糖酶及碱性磷酸酶活性均低于2016 年，而过氧化氢酶活性则升高，可能是2017 年拔节期干旱少雨而灌浆期持续降雨对土壤水热状况产生影响造成的。

3.2 各处理测序深度及多样性指数的差异

分析OTU 数量，施用有机肥各处理OTU 数量均高于CK，且YJ4 处理OTU 数量最多，表明施用有机肥可以增加土壤OTU 数量，提高细菌多样性。而随着有机肥施用量继续增加，YJ5 处理OTU 数量反而低于YJ4 处理，可能是变形菌门等优势菌门丰度过高，从而抑制了其他细菌群落丰度。Teixeira 等［24］、高圣超等［25］研究都发现施入有机肥提高了土壤细菌的16S rRNA 基因拷贝数，本研究结果与前人研究一致。本试验中，施用有机肥各处理Chao1 指数和ACE 指数均较CK 明显提高，表明施入有机肥提高了细菌的丰富度与多样性，且整体表现为施入量越多，细菌的丰富度与多样性越高，可能是土壤环境改变造成的，施入有机肥能改善土壤性状、提升肥力，为细菌提供适宜生长环境。本研究结果表明，不同有机肥施用量对土壤细菌群落香农指数和辛普森指数的影响不同，低施用量处理（YJ1、YJ2、YJ3）降低香农指数，土壤细菌群落多样性降低，可能是较低的施用量刺激土壤优势菌门生长发育，提高其竞争力导致的，而高施用量处理短期内可提高土壤细菌群落多样性。

3.3 施用有机肥对细菌群落构成的影响

前人研究发现土壤中变形菌门、放线菌门和酸杆菌门丰度值占所有优势菌门的70%以上［26］，也有研究表明，施用有机肥还提高了土壤微生物群落多样性和丰富度，固氮菌微生物相对丰度呈下降趋势［20］。变形菌门包括丰富的固氮细菌，本试验中施用有机肥各处理提高了变形菌门丰度，与土壤脲酶活性表现规律一致，即YJ2 最高，YJ4 最低。YJ4 处理总OTU 数目虽然最高，却较CK 降低了变形菌门等有益的优势菌种，反而增加了可能致病的放线菌门等；YJ2、YJ3 处理虽然总OTU 数量低于YJ4，却略高于CK，同时提高变形菌门丰度并降低放线菌门丰度。厚壁菌门为富营养细菌，土壤可利用碳含量较高有利于其生长发育［27］。施用有机肥还提高厚壁菌门相对丰度，参与土壤养分分解，供玉米生长所需，同时可以抵抗脱水和极端环境，能够分解土壤中脂肪和碳水化合物等物质，同时还能抵御外来病原体的入侵。研究表明长期施用化肥降低土壤细菌群落多样性［28］，结合本研究，通过有机肥与无机肥料配施可能提高土壤细菌群落的多样性。

4 结论

施用有机肥显著提高了4 种土壤酶活性，尤以YJ2 处理增幅最大，年际间水热等因素影响了土壤酶活性。施用有机肥各处理OTU 数量均高于CK，提高了细菌多样性，且有机肥会对细菌的群落多样性产生影响，影响程度与施用量有关。ACE 指数、Chao1 指数、香农和辛普森指数均为YJ4 处理最高。施用有机肥提高了土壤变形菌门和厚壁菌门的相对丰度，尤以YJ2 与YJ3 处理效果最佳；YJ4 处理放线菌门丰度高于CK，而其他处理均降低了放线菌门相对丰度。冗余分析表明，过氧化氢酶和蔗糖酶活性对黑土细菌群落多样性影响较大。