液相色谱-原子荧光法测定化妆品中硫柳汞和苯基汞

焦旭静 冯 婷 裴晓华 薛辰全 董应尚

(1.北京吉天仪器有限公司，北京 100015；2.山东省荷泽生态环境检测中心，荷泽 274000)

1 前言

硫柳汞和苯基汞是一类含汞的有机化合物，长期以来一直做为防腐剂被广泛应用于眼科制剂和生物疫苗。硫柳汞的代谢或降解产物为乙基汞和水杨酸钠，其作用机制为汞离子与菌体中酶蛋白的-SH(巯基)结合而使酶失去活性[1]从而抑制细菌生长；苯基汞具有抑制霉菌的作用。汞化合物会破坏表皮层的酵素活动,使黑色素无法形成，具有一定的美白功效，导致一些不法商人将汞类化合物违法添加至化妆品中。虽然硫柳汞和苯基汞具有抑菌、美白的作用，但是它们存在一定的毒性，在使用时容易通过皮肤等吸收到体内，并且在体内具有蓄积性，可能会引起中毒，引发神经性疾病[2]。《GB 7916-1987化妆品卫生标准》中对化妆品中硫柳汞含量和范围做了相关规定，用量不超过0.007%(汞计)，仅用于眼部化妆品和眼部卸妆品[3]。

目前，针对化妆品中硫柳汞和苯基汞的检测方法很多，常见的液相色谱法[4]、原子吸收分光光度法分光光度法[5]、紫外分光光度法[6]、有高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法[7]和毛细管电泳法[8]等。本实验参考2019年06月04日发布的《GB/T 37649-2019 化妆品中硫柳汞和苯基汞的测定 高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法》[9]中样品预处理方法，建立了用液相色谱进行分离，原子荧光光谱仪进行测定的化妆品中硫柳汞和苯基汞的方法，该方法检出限低，分析速度快，精密度好，仪器性价比高，适用于化妆品中硫柳汞和苯基汞的检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

SA50-Kylin S18液相色谱-原子荧光联用仪(北京吉天仪器有限公司)；KQ-300DE台式数控超声波清洗器(东莞市科桥超声波设备有限公司)；3-18R冷冻离心机(恒诺仪器)。

硫柳汞标准品(纯度96%，Dr.Ehrenstorfer)；苯基汞标准品(纯度91%，Dr.Ehrenstorfer)。

盐酸(优级纯)；氢氧化钾(分析纯)；硼氢化钾(优级纯)；甲醇(色谱纯)；L-半胱氨酸(优级纯)；乙酸铵(优级纯)；实验用水均为实验室超纯水。

2.2 仪器工作条件

液相色谱条件：色谱柱(Agela Venusil MP C18 4.6*150mm，5μm)；保护柱(Agela C18保护柱4.6*10mm)；柱温箱30℃；洗脱方式：梯度洗脱(详见表1)；流动相A：甲醇，流动相B：乙酸铵溶液(60mmol/L乙酸铵+0.1%L-半胱氨酸)；流速为1mL/min；进样量为100μL。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

原子荧光条件：负高压：290V；Hg灯灯电流(40mA)；载气：300mL/min；屏蔽气：500mL/min；炉高：12mm；蠕动泵转速：65r/min；载流：5%HCl；还原剂：1.5%KBH4+0.5%NaOH。

2.3 标准溶液的配制

标准储备液配制：准确称取5mg硫柳汞标准品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，制得硫柳汞标准储备液 (500mg/L)；准确称取5mg苯基汞标准品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，制得苯基汞标准储备液(50mg/L)。

标准中间液配制：分别准确移取0.1mL硫柳汞标准溶液 (50mg/L)和0.25mL苯基汞标准溶液 (500mg/L)于10mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，制得混合标准中间液(硫柳汞500μg/L，苯基汞12.5mg/L)；储存在0～4℃冰箱备用。

标准工作液配制：准确移取0.050mL、0.10mL、0.25mL、0.50mL、1.0mL混合中间液(硫柳汞500μg/L，苯基汞12.5mg/L)分别加入到10mL容量瓶中，分别加入3mL甲醇，用乙酸铵溶液定容至刻度，制得一系列标准工作溶液(硫柳汞浓度分别为2.5μg/L、5.0μg/L、12.5μg/L、25.0μg/L、50.0μg/L ；苯基汞浓度分别为62.5μg/L、125.0μg/L、312.5μg/L、625.0μg/L、1250μg/L )。

2.4 样品处理

称取0.2g样品于15mL刻度离心管中，加入4.5mL甲醇，超声提取30min后，用乙酸铵溶液定容至15mL，混合均匀，置于8000r/min高速离心机上离心15min，取上清液经0.45μm过滤，滤液进行上机检测，同时做样品空白。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的优化

流动相的条件对汞化合物的分离效果和灵敏度起到了关键性的作用，考察洗脱硫柳汞和苯基汞时甲醇的比例为10%、20%、30%、40%和50%时对分离度和灵敏度的影响，随着甲醇比例的升高，硫柳汞和苯基汞的分离度逐渐减小，甲醇比例为50%时分离度为2.3，甲醇比例为30%时硫柳汞的灵敏度最高，甲醇比例为50%时苯基汞的灵敏度最高，为了兼顾分离度和灵敏度，最终选择甲醇比例为50%，可有效的洗脱硫柳汞和苯基汞。

3.2 原子荧光光谱条件的优化

本实验考察了KBH4浓度为1%、1.5%、2%、3%和4%(m/V)对硫柳汞和苯基汞荧光强度的影响。如图1所示，当浓度为1.5%时硫柳汞和苯基汞具有最高的荧光强度，继续提高KBH4浓度，硫柳汞和苯基汞的荧光强度反而有不同程度的下降，故本实验选择KBH4溶液的浓度为1.5%(m/V)。

3.3 样品前处理条件的选择

本实验中化妆品试样处理选用10mL甲醇溶解样品，超声提取后用乙酸铵溶液定容至15mL，本实验考察了加入4.5mL、7.5mL和10mL甲醇溶解样品，对峰型及加标回收率的影响。实验结果显示，加入7.5mL和10mL甲醇溶解样品时，硫柳汞和苯基汞的峰展宽，硫柳汞的峰有毛刺，且加标回收率均偏低，加入4.5mL甲醇溶解样品时，硫柳汞和苯基汞峰型最好，加标回收率高，故本实验选用4.5mL甲醇溶解样品，实验过程中，标准工作液中的甲醇比例也需与试样中的甲醇比例一致，避免产生溶剂效应。

3.4 方法学考察

3.4.1方法重复性

配制混合标准溶液(硫柳汞25μg/L，苯基汞625μg/L)进样100μL, 连续进样7针，以保留时间来衡量定性重复性，以峰面积来衡量定量重复性，详细结果见表2，保留时间相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为0.30%～0.33%，峰面积相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为4.22%～4.96%，表明仪器具有良好的重复性。

表2 硫柳汞和苯基汞的仪器方法重复性(n=7)

3.4.2方法检出限、定量限及线性

将硫柳汞和苯基汞系列混合工作液进行测定，以峰面积为纵坐标，相应的标液浓度(μg/L)为横坐标，进行线性回归计算，得到线性方程和相关系数；以信噪比S/N=3 确定检出限(limit of detection，LOD)。实验结果如表3所示，硫柳汞在2.5μg/L～50μg/L和苯基汞在62.5μg/L ～1250μg/L的范围内线性相关性较好，线性相关系数(r)大于0.999，硫柳汞检出限为0.060μg/L，苯基汞检出限为0.23μg/L，色谱图见图2。

表3 硫柳汞和苯基汞的保留时间、线性方程、相关系数、检出限和定量限

图2 硫柳汞和苯基汞色谱图

3.4.3方法的回收率

选取化妆水、卸妆油、眼霜、乳液和珍珠霜5种样品作为实验样品，测样品中硫柳汞和苯基汞的本底值，并分别对样品进行3个浓度的加标回收实验，每个浓度6个平行实验，结果表明：硫柳汞的加标回收率为84.7%～101.7%，苯基汞的加标回收率为84.1%～103.9%，该方法具有良好的准确性。

3.5 实际样品的测定

应用本研究所建立的方法，对市售的5种化妆品(化妆水、卸妆油、眼霜、乳液和珍珠霜)进行检测，检测结果发现，样品中硫柳汞和苯基汞均为未检出，详细结果见表4。

表4 样品中硫柳汞和苯基汞的本底值及加标回收率

4 结论

建立了液相色谱-原子荧光光谱联用技术检测化妆品中硫柳汞和苯基汞的方法，样品采用甲醇超声提取的方式，采用甲醇和乙酸铵溶液(0.06mol/L乙酸铵+0.1%L-半胱氨酸)作为流动相进行梯度洗脱，经C18(4.6*150mm，5μm)柱分离后经原子荧光测定，11min内可实现硫柳汞和苯基汞的分析测试。硫柳汞和苯基汞标准曲线线性相关系数(r)均大于0.999，硫柳汞的检出限为0.060μg/L，苯基汞的检出限为0.23μg/L(S/N=3)，硫柳汞和苯基汞的回收率在84.1%～103.9%之间。实验所建立的方法与国标《GB/T 37649-2019 化妆品中硫柳汞和苯基汞的测定 高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法》对比，分析时间短，灵敏度高，检出限低，可对化妆品中硫柳汞和苯基汞进行更快速准确的测定，对化妆品安全风险监测具有重要意义。