抽动障碍患者血清Sirt1和IL-8水平

刘海春 徐向平

抽动障碍(tic disorders，TD)是起病于儿童或青少年时期的一组综合征，其特征为不自主的、反复的、突发的、快速的、重复的、无节律的一个或多个部位的运动抽动，伴有或者不伴有发声抽动。抽动障碍一般病程较长，症状常反复变化不定，病情迁延，部分可发展为难治性抽动，严重影响患者身心健康和社会功能。抽动障碍现有的治疗药物相对副作用大，药物治疗疗程较长，用药总疗程1～2年[1]，如果症状再发或加重，则需重新给药治疗甚至考虑加大用药剂量。患者用药依从性差，治疗效果欠佳。由此可见深入研究TD的发病机制，针对发病机制开展有效治疗，具有重要的意义和价值。

抽动障碍的病因目前尚不明确，大量研究证实其发病机制与免疫失调有关[2]，患者血液中多种细胞因子发生变化，包括TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、MCP-1等升高。Sirt1是沉默信息调节因子2(silent information regulator2，Sir2)相关酶1，是一种NAD+依赖性蛋白质脱乙酰酶，其调节作用涉及多个过程，从肿瘤发生，到神经元发育，到糖脂等物质代谢，并且是免疫反应的关键调节器[3]。Sirt1的免疫调节作用是近年的研究热点，大量研究证明其可通过抑制NF-κB及AP-1通路降低TNF-α和多种白介素水平[4]，包括IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8等，并可以调节MCP-1水平。基于Sirt1的免疫调节作用以及免疫失调对抽动障碍发病的影响，我们推测Sirt1的表达水平可能与TD患者免疫失调有关。Sirt1作为白介素和TNF-α等多种细胞因子的调控因子，它在TD患者血清中有何变化，是否参与TD的免疫调节，目前尚未见报导。IL-8是淋巴细胞分泌的趋化性细胞因子，主要趋化并激活中性粒细胞，导致机体的炎症反应。Sirt1可以通过NF-κB通路抑制IL-8的表达。有研究表明抽动障碍患者血清中多种白介素升高，但细胞因子IL-8在TD患者血清中有何变化，目前报导较少。本研究将测定抽动障碍患者血清Sirt1和细胞因子IL-8水平，以明确TD患者血清IL-8和Sirt1的变化，初步探讨Sirt1在TD免疫调节中的作用。

对象与方法

一、研究对象

选择2017年8月至2018年1月就诊于哈尔滨医科大学附属第一医院儿科门诊及病房且符合抽动障碍诊断标准的患儿100人为实验组，其中男性72例，占72.0%；女性28例，占28.0%，平均年龄：(8.8±2.9)岁。抽动障碍的诊断标准参照《美国精神疾病诊断与统计手册》第5版(DSM- V)。所有患儿就诊时均未服用《儿童抽动障碍诊断与治疗专家共识》[1]推荐使用的治疗药物。选择同期在哈尔滨医科大学附属第一医院儿科门诊进行体检的健康儿童78人为对照组，年龄和性别与抽动障碍组相匹配，无免疫性疾病病史，近期无感染及过敏性疾病。其中男性55例，占70.5%；女性23例，占29.5%，平均年龄为(9.6±3.6)岁。本研究通过哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会审批，所有研究对象家长均签署知情同意书。

二、血清Sirt1蛋白及IL-8浓度的检测

取抽动障碍患者组及健康对照组空腹静脉血5 ml，于室温下静置2 h，离心(3000转×10 min)，分离血清，-20 ℃冰箱贮存备用。

1.血清Sirt1蛋白浓度的检测：(1)将-20 ℃冰箱贮存的血清在检测前12 h移入4℃冰箱，检测前室温下放置30 min；(2)将人血清Sirt1的ELISA试剂盒(EK-Bioscience，上海酶研生物科技有限公司)放置室温中平衡20 min，充分混匀各试剂；(3)向标准品孔分别加入不同浓度的标准品50 ul(S0为空白孔)，Sirt1标准品(S0-S5)浓度依次为：0 ng/ml、1.25 ng/ml、2.5 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml；(4)依次向样本孔加入样本稀释液和待测样本，加入量分别为40 ul和10 ul；(5)将辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体加入标准品孔和样本孔中，每孔加入100 ul，空白孔(S0)不加，然后用封板膜密封反应孔，于微量振荡器上充分混匀30 s，立即放入37℃恒温箱中温育60 min；(6)向洗液瓶中加入蒸馏水475 ml，再加浓缩洗涤缓冲液25 ml，混匀；(7)取出温育后的酶标板，将液体弃去，在吸水纸上拍干，把配置好的洗涤液加入各孔中，加满后静置1 min，甩去洗涤液，再次于吸水纸上拍干酶标板，重复洗板5次，方法同前；(8)每孔加入底物A 50 ul，加入底物B 50 ul，37 ℃避光孵育15 min；(9)取终止液加入各孔，每孔50 ul，立即用酶标仪在450 nm波长条件下测定各孔的OD值；(10)使用Excel 2010绘制标准品线性回归曲线，其中横坐标为标准品浓度，纵坐标为对应的OD值，通过曲线方程和样本OD值，计算对应样本浓度。将计算值放大5倍后得到最终Sirt1浓度值。

2.血清IL-8浓度的检测：准备好需检测的血清样本和人血清IL-8的ELISA试剂盒(EK-Bioscience，上海酶研生物科技有限公司)，IL-8标准品(S0-S5)浓度依次为：0 pg/ml、7.5 pg/ml、15 pg/ml、30 pg/ml、60 pg/ml、120 pg/ml，检测过程同上述血清Sirt1检测方法。血清Sirt1和IL-8浓度检测全部样品同批次完成。

结 果

一、抽动障碍组和对照组基线资料比较：抽动障碍组和健康对照组基线资料比较，TD组平均年龄为(8.8±2.9)岁，对照组平均年龄为(9.6±3.6)岁，两组平均年龄经两独立样本t检验结果显示，差异无统计学意义(P>0.05)；TD组男72例，女28例，对照组男55例，女23例，两组性别经χ2检验结果显示，性别比例差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。说明两组样本基线资料基本一致，具有可比性。

表1 TD组和健康对照组基线资料比较Table1 Comparison of baseline characteristics between TD group and control group

二、血清Sirt1和IL-8浓度测定结果：采用ELISA方法测定的Sirt1浓度标准曲线曲线方程为y=0.0906x+0.0037，相关系数R值为0.9988，详见图1。TD组血清Sirt1浓度值为(19.1±8.8) ng/ml，对照组血清Sirt1浓度值为(23.3±9.9)ng/ml，两组血清Sirt1浓度比较显示，TD组明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。采用ELISA方法测定的IL-8浓度标准曲线方程为y=0.019x+0.0781，相关系数R值为0.9953，详见图2。TD组血清IL-8浓度值为(141.6±53.6)pg/ml，对照组血清IL-8浓度值为(157.0±61.1)pg/ml，两组血清IL-8浓度差异无统计学意义(P>0.05)，详见表2。

表2 TD组和健康对照组Sirt1、IL-8浓度比较Table 2 Comparison of Sirt1 and IL-8 concentration between TD group and control group

图1 采用ELISA方法测定的Sirt1标准曲线Figure 1 Standard curve of Sirt1 measured by ELISA method

图2 采用ELISA方法测定的IL-8标准曲线Figure 2 Standard curve of IL-8 measured by ELISA method

讨 论

抽动障碍病因复杂，目前尚不明确，多数学者认为遗传因素、神经递质的失衡、神经元异常、激素和微量元素水平、社会精神因素都参与了抽动障碍的发病[5]，近年来越来越多证据表明，免疫功能紊乱在抽动障碍的发病机制中也占有重要地位。

临床上抽动障碍患儿在某次细菌或病毒感染后常出现症状加重或病情反复的现象，利用细菌或病毒模仿主动免疫可建立Tourette综合征(tourette syndrome，TS)动物模型，这些都间接印证了抽动障碍可能与免疫紊乱关系密切。自从链球菌感染相关性儿童自身免疫性神经精神障碍(pediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infections，PANDAS)概念的提出学者们发现抽动障碍的发生与链球菌感染有一定关系。后来另一些学者发现多数TS患者血清或脑脊液中存在大量的抗神经元抗体，且这种抗体又可以诱导与TS症状相似的抽动动物模型。学者们对TS患者细胞因子和免疫球蛋白的检测，对淋巴细胞亚群和外周淋巴细胞基因表达谱的研究，发现抽动障碍患者可能存在过度活跃的系统性免疫应答[2]。

近年来许多学者对抽动障碍伴有或不伴有强迫障碍的患者外周血细胞因子进行了检测并得出结论：IL-12和IL-2在TD发病中起一定作用，且血清IL-2浓度与抽动严重程度评分呈正相关[6]；TS患者血IL-1β，IL-6，IL-17等均显著升高，抗核抗体阳性，抗链球菌溶血素阳性[7]；细胞因子紊乱在抽动障碍的发病机制中扮演了重要角色，并且监测细胞因子，特别是TNF-α，对诊断有潜在的帮助[8]。Yeon等人排除共患病和药物的影响，对患者血清炎性细胞因子进行了测定，结果发现患者血清lL-12和TNF-α升高，并且未服药患者TNF-α更高[9]。Gariup等人对包括情感障碍、适应障碍、抽动障碍、焦虑症和强迫症的精神神经障碍患者进行了多种细胞因子的测定，结果显示IL-8在所有类型的患者中均有显著增高[10]，但研究中抽动障碍患者例数较少；与此不同，程德君等研究发现，抽动障碍患儿血清IL-8并未发生显著变化[11]。多数学者认为TD患者血清中多种细胞因子水平升高，细胞因子的紊乱可能参与了TD的发生，其介导的炎症通路可能是TD发病的重要机制。IL-8是淋巴细胞分泌的趋化性细胞因子，主要趋化并激活中性粒细胞，导致机体的炎症反应。随着研究的深入，学者们发现IL-8能作用于不同细胞，它可以促进炎症反应进程、刺激血管的形成、调节机体免疫功能等，与多种免疫性疾病的发生和发展密切相关。本研究检测抽动障碍患者的血清IL-8水平，实验结果显示抽动障碍患儿和健康儿童的血清IL-8水平没有统计学差异，此结果与程德君等检测TD患者血清IL-8结果相同。但Gariup等人检测发现抽动障碍患者血IL-8水平升高，此结果可能与其实验检测的TD患者只有8例有关，而本研究检测的TD患者有100例，可以避免患者例数过少引起的误差。

Sirt1是一种NAD+依赖性蛋白质脱乙酰酶，其调节功能参与了肿瘤发生、神经元发育、物质代谢等过程，并且是免疫反应的关键调节器。研究证明Sirt1主要通过NF-κB和AP-1通路[4]抑制促炎细胞因子的释放，降低TNF-α和多种白介素水平，在炎症性疾病的调控中起重要作用。

核因子NF-κB是一种普遍表达的转录因子，可控制许多参与炎症的基因表达，因此NF-κB通路是刺激炎症细胞因子和淋巴细胞活化的中心信号传导节点。Sirt1可使NF-κB脱乙酰化，抑制NF-κB转录活性[12]。而NF-κB通路的抑制可以减少巨噬细胞、内皮细胞等产生炎症因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、COX-2等。除了NF-κB途径，核因子AP-1转录活性在免疫应答的激活中也具有重要作用。Sirt1与AP-1的亚基相互作用，并在T细胞和巨噬细胞中去乙酰化AP-1，抑制AP-1通路，减少IL-2的产生。

Barroso等人通过实验证实Sirt1的激活可以抑制TNF-α诱导的NF-κB活化，从而降低NF-κB靶基因IL-8的转录表达，而在Sirt1抑制剂存在的情况下，细胞中IL-8 mRNA的水平则不降低[13]。Sadarani等人对慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者研究表明，白藜芦醇和地塞米松联用可以降低COPD患者肺泡灌洗液中白细胞和TNF-α、IL-8等炎症因子水平，而使用sirtinol(Sirt1抑制剂)后，其抑制炎症因子的作用基本消除[14]。Kim等人研究证实，一氧化碳的处理增加了缺血再灌注损伤肝细胞中Sirt1的表达，并且减少了肝脏中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子[15]。Lv等人通过对脑卒中大鼠脑组织中Sirt1和细胞因子的检测发现，丹酚酸B可以激活Sirt1，抑制炎症反应，降低卒中大鼠脑组织中的TNF-α、IL-1β水平，减少细胞凋亡，起到保护脑组织的作用[16]。

Sirt1具有抑制炎症反应、调节免疫功能的作用，对类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性脑脊髓炎等多种免疫相关性疾病有抑制作用。本研究检测抽动障碍患儿血清Sirt1水平，结果显示抽动障碍患儿血清Sirt1水平较健康儿童明显降低(P<0.005)，这表明Sirt1水平的降低可能导致免疫紊乱，参与抽动障碍的发生。

综上所述，抽动障碍患者血清Sirt1浓度降低，提示Sirt1可能调节免疫，参与抽动障碍的发生。