??????湘南脐橙柑橘黄龙病的PCR检测及内生细菌的分离

雷平 黄彬彬 黄军 毕世宇 郭照辉 刘清术 唐滢

摘 要：为确保湘南脐橙产业发展安全，严格防控柑橘黄龙病，从湘南地区几个脐橙种植园采集柑橘黄龙病疑似病株样品和健康植株样品，利用文献报道的柑橘黄龙病PCR检测常用引物对样品进行分子检测，并从病株组织中分离内生细菌进行分析鉴定。结果表明：在柑橘黄龙病的常规PCR检测中，湘南脐橙总核酸对P400引物的灵敏度最高，是湘南地区脐橙中柑橘黄龙病害常规PCR检测的最佳引物，其次为P535引物，而OI和16S这2对引物的灵敏度较低;对脐橙中柑橘黄龙病病株组织内生细菌的分离鉴定发现，柑橘中可培养内生细菌主要归类为7个属，分别为短杆菌属（Curtobacterium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、异常球菌属（Deinococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、微杆菌属（Microbacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）;其中，LB和1/10LB培养基中的优势菌属为短杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和芽孢杆菌属;而脐橙树叶汁培养基中的优势菌属为短杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和微杆菌属。

关键词：脐橙;柑橘黄龙病;PCR检测;内生细菌;湘南

中图分类号：S432.42文献标识码：A文章编号：1006-060X（2020）07-0001-04

Abstract： In order to ensure the industry security of navel orange （Citrus sinensis Osb. var. brasliliensis Tanaka） in South Hunan and keep strict prevention or control of citrus Huanglongbing （HLB）， the diseased and healthy samples were collected from 4 navel orange ochards of Yizhang County， Chenzhou City， Hunan Province for the PCR detection of citrus HLB pathogen and the isolation of endogenous  bacteria. 4 kinds of PCR primers were used. In the routine PCR detection of citrus HLB， total nucleic acid of citrus HLB pathogen in the navel orange leaves has the highest sensitivity to primer P400 which is the optimal for PCR detection of citrus HLB for southern Hunan navel orange， followed by primer P535， while OI and 16S primers have lower sensitivity. Curtobacterium， Sphingomonas， Deinococcus， Pseudomonas， Methylobacterium， Microbacterium and Bacillus are seven species of culturable endogenous bacteria isolated from diseased samples. Curtobacterium， Sphingomonas and Bacillus are the dominant genera isolated with LB and 1/10LB， while Curtobacterium， Sphingomonas and Microbacterium are the dominant genera isolated with navel orange leaf juice + agar.

Key words： navel orange （Citrus sinensis Osb. var. brasliliensis Tanaka）; citrus Huanglongbing （HLB）; PCR detection; endogenous  bacteria; South Hunan

湘南地處我国三大柑橘产业带（赣南—湘南—桂北），具有独特的气候、资源、区位、交通和人才优势。湘南脐橙种植面积已远超1.8万hm2（该面积为《宜章县产业发展规划（2002—2010）》和《宜章县产业发展规划（2012—2017）》中规划的脐橙发展面积），成为了当地经济的支柱产业，特别是郴州的“宜章脐橙”已注册成地理商标，具有较大的发展前景[1]。但随着气候的变暖，湘南脐橙受到了从华南地区向北扩散的柑橘黄龙病的影响，部分果园频繁出现果树叶片斑驳黄化，甚至果树枯死和毁园的现象。因此，加强脐橙的检疫与防治工作，对于湘南脐橙产业乃至湘南和湖南柑橘产业的发展有着重大的现实意义。

自20世纪初柑橘黄龙病首次在我国发现以来，先后在广东、广西、福建、台湾等地区发生，且为害较为严重。虽然云南、贵州、浙江、四川、湖南等地也有发现，但属零星分布，主要是苗木运输所致，加强苗木监控即可有效遏制病情发生。然而，由于近年来全球气温持续变暖，柑橘木虱活动范围不断北扩，柑橘黄龙病的发生有逐渐向北扩散的趋势，湘南地区由于临近广东、广西等柑橘黄龙病高发区，故首当其冲地遭受柑橘黄龙病的为害。Gao等[2]的血清学试验和Bastianel等[3]基于OMP基因的酶切分型试验都表明柑橘黄龙病病原亚洲种具有较大的分化。董俊[4]的研究表明，华南地区的柑橘黄龙病病原存在着多种亚种的分化，并且其遗传分化的规律主要取决于地域的分布和寄主植物品种的差异。虽然近年来有一些针对湖南地区的柑橘黄龙病的分子检测研究[5-6]，但是关于湘南柑橘，特别是湘南脐橙柑橘黄龙病PCR检测引物及病原伴生菌的研究尚未见报道。因此，笔者通过常规技术以多组柑橘黄龙病PCR检测引物对湘南脐橙主产区——宜章的脐橙黄龙病株进行检测鉴定，以期筛选出对湘南脐橙具有高特异性、高灵敏度的柑橘黄龙病PCR检测引物，并从阳性病株中分离出一些柑橘黄龙病病原的伴生菌，为湘南地区脐橙柑橘黄龙病的诊断及防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 采 样

脐橙枝叶样品采自湖南省郴州市宜章县4个不同的脐橙种植园（图 1）。采样植株为 6～10年生脐橙，主要采集1～3年生叶片，图1中1～3号均为柑橘黄龙病株阳性样品且病害程度递增，4号样品为柑橘黄龙病株阴性样品。所有样品均由宜章县农业局植保站提供。采样时间为2018年6月上旬，样品采摘后带回室内4℃保存，3 d内进行检测和分离培养。

1.2 脐橙柑橘黄龙病的PCR检测

参考高玉霞等[7]的方法提取植物叶片总核酸，略作调整。基本步骤：叶片清洗干净并凉干后，切取叶片0.5 g，置于干净的研钵中，用液氮快速研磨成粉末状;收集到1.5 mL无菌离心管中，加入500 μL TES缓冲液（0.1 mol/L Tris-HCl，pH值8.0;2 mmol/EDTA，pH值8.0;2% SDS）漩涡混匀;加入500 μL酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1的混合液;漩涡5 min混勻;室温12 000 r/min离心5 min，吸取上清液用1 mL无水乙醇和100 μL的NaAc混匀，-20℃ 5 min沉淀;室温12 000 r/min离心3 min去掉上清液，然后用500 μL 75%乙醇清洗2次;室温12 000 r/min离心3 min，沉淀在常温下风干，加入100 μL无菌水溶解，即为总核酸样品，-20℃保存。

PCR引物：根据相关文献报道，选取16S引物对[7]、P400引物对[8]、P535引物对[9]、OI引物对[10]进行脐橙柑橘黄龙病检测，引物序列见表1，由湖南擎科生物有限公司合成。

PCR检测体系：2×PCR Mix buffer 25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，模板1 μL，添加双蒸H2O至50 μL。所有试剂均为宝生物工程（大连）有限公司TAKARA系列产品。

16S引物PCR扩增程序：94℃ 5 min→94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循环30 次→72℃10 min→4℃保存。P400引物PCR扩增程序：94℃5 min→94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，循环30次→72℃ 10 min→4℃保存。P535引物PCR扩增程序：94℃ 5 min→94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循环32次→72℃ 10 min→4℃保存。OI引物PCR扩增程序：94℃ 5 min→94℃ 30 s，61℃ 1 min，72℃ 1.5 min，循环32次→72℃ 10 min→4℃保存。

1.3 脐橙柑橘黄龙病株内生细菌的分离鉴定

内生菌的分离参考王真真等[11]的方法，进行细微的调整。将采摘的1～3号脐橙样品的叶片和枝条剪下用清水洗净泥沙，置于超净工作台中吹干;放入磷酸氢二钠溶液中超声1 min进一步去除表面杂质，从中取出植物组织依次用无水乙醇、4%次氯酸钠、硫代硫酸钠进行表面消毒，消毒后用大量无菌水清洗以去残留的消毒剂;取最后一步清洗液涂布LB平板检测表面消毒是否彻底，将消毒彻底的植物组织置于超净工作台中吹干;然后将样品研磨成浆液，分别取1、10、100 μL汁液涂布LB、1/10 LB固体培养基和脐橙叶汁培养基平板，每种培养基涂布5个平板，30℃培养箱中培养3～7 d，挑取单菌落至LB平板划线，获得纯培养物。

3种培养基制备方法如下。（1）LB固体培养基：蛋白胨10 g、牛肉浸膏10 g、氯化钠3 g、琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值6.5±0.5。（2）1/10LB液体培养基：用蒸馏水将LB培养基稀释10倍后，调节pH值6.5±0.5。（3）脐橙叶汁培养基：将100 g新鲜健康脐橙叶洗净、剪碎，加入500 mL超纯水后用榨汁机榨汁，叶汁高速离心后上清经过0.22 μm过滤器进行除菌，将200 mL过滤叶汁加入等体积灭菌后的2倍水琼脂培养基中（琼脂 40 g，蒸馏水1 000 mL，pH值6.5±0.5），混合均匀后倾倒平板。

菌株的鉴定利用 CTAB 法提取菌株纯培养的基因组DNA，进行16S rDNA的PCR扩增，PCR扩增引物、反应体系及扩增程序参照王芳[12]的方法。扩增产物送至湖南擎科生物测序，将测序结果在NCBI数据库中进行 Blast 比对分析。

2 结果与分析

2.1 湘南脐橙采用不同引物进行柑橘黄龙病PCR检测的结果

2.1.1 样品总核酸提取质量 如图2所示，4个样品的总核酸提取较为成功，目的条带亮度较高，符合后续PCR检测要求。

2.1.2 不同引物扩增结果 如图3所示，2号样品和3号样品采用P535和P400引物均扩增出柑橘黄龙病基因条带，1号样品只有P400引物扩增出了条带，而16S和OI这2对引物在4个样品中均未扩增出条带;从扩增出的条带亮度来看，P400引物扩增出的条带较为清晰，且目的条带的亮度与病害发病程度呈正相关性。因此，可以认为在柑橘黄龙病的常规PCR检测中，湘南脐橙总核酸对P400引物的灵敏度最高，其次为P535引物，而OI和 16S这2对引物的灵敏度较低。

2.2 湘南脐橙中柑橘黄龙病株内生细菌的分离结果

试验结果显示，从1～3号湘南脐橙样品中分离挑选出180株细菌，通过16S rDNA测序分析发现这些菌株分别属于短杆菌属（Curtobacterium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、异常球菌属（Deinococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、甲基杆菌属（Methylobac-terium）、微杆菌属（Microbacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）;其中，LB，1/10LB和脐橙叶汁培养基中分别挑取60株，LB培养基中有短杆菌属15株 、鞘氨醇单胞菌属13株、芽孢杆菌属13株为优势菌属;1/10 LB培养基中有短杆菌属12株 、鞘氨醇单胞菌属10株、芽孢杆菌属8株为优势菌属;而在脐橙树叶汁培养基中有短杆菌属11株、鞘氨醇单胞菌属8株、微杆菌属7株为优势菌属;分离鉴定部分结果见表2。

3 结论与讨论

柑橘黄龙病是一类专性寄生在芸香科植物韧皮部的植物病害，研究表明，柑橘黄龙病病菌会引起筛孔堵塞，导致植物筛管运输糖类、养分等可溶性有机物的功能丧失，最终导致植物叶片缺素、黄化、斑驳甚至枯萎死亡[13]。当前对于柑橘黄龙病既无特效治疗药物也无抗性品种，这使得该病对柑橘生产造成毁灭性打击，号称“柑橘癌症”，一旦发病就无可救药，只能做出“砍一株保一园，砍一园保一片，砍一片保一业”的下策[14-15]。而目前，湘南地区的脐橙产业发展势头正旺盛，特别是“宜章脐橙”因其独特的气候、土壤等优势已成功申报地理证明商标。但随着气候变暖，柑橘木虱的北扩，使得当地许多果园出现了果树叶片黄化，果实青化、畸形及植株枯死的现象。因此，寻求一组高特异性、高灵敏度、高稳定性的柑橘黄龙病PCR检测引物，帮助种植户在生产中及时、快捷地确诊湘南地区脐橙的柑橘黄龙病病害显得尤为重要，对湘南地区脐橙产业的发展也具有重要意义。此外，借助植物内生菌在植物体内普遍存在这一自然特性以及其与植物亲和的天然优势，利用内生菌来防治植物病害现已成为了一种绿色、高效的植物病害防治措施[16]。因此，研究从湘南地区几个脐橙种植园采集柑橘黄龙病疑似病株样品和健康植株样品，利用柑橘黄龙病PCR检测常用引物对样品进行分子检测，并从病株组织中分离内生细菌进行分析鉴定，为湘南地区脐橙的柑橘黄龙病害检测与防控提供一定的参考。

试验结果表明，P400引物是湘南地区脐橙中柑橘黄龙病害常规PCR检测的最佳引物;对脐橙中柑橘黄龙病病株组织内生细菌的分离鉴定发现，柑橘中内生细菌主要归类为7个属，分别为短杆菌属（Curtobacterium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、异常球菌属（Deinococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、微杆菌属（Microbacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）;其中，LB和1/10LB培养基中的优势菌属为短杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和芽孢杆菌属;而脐橙树叶汁培养基中的优势菌属为短杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和微杆菌属。

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（责任编辑：成 平）