抗犬细菌性皮肤病中药的筛选

范书慧，李春花*，柴方红

1.吉林农业科技学院，吉林吉林市 132109；2.吉林省牧业信息中心，吉林长春 130000

犬细菌性皮肤病是由于细菌感染发炎而引起的，又称脓皮症，是犬经常发生的皮肤病之一。大多数病例的病原为葡萄球菌[1]，也可能会发现化脓性杆菌、奇异变形杆菌等微生物通过一系列不同的机制来导致机体发病和死亡[2]。

临床上治疗更多选择用抗细菌的西药，但西药价格比较高，并且长期使用具有明显耐药性，抗生素的大量使用是导致抗生素耐药性主要原因[3]。随着耐药菌株的增多和犬的细菌性皮肤病复发率的增高，这让兽医研究者更加努力研究新型抗细菌药物。目前传统医学临床实践以及根据文献报道证实多种中药对细菌均有不同程度的抗菌作用，并且部分中药还不能使细菌产生耐药性。

因此，本试验选取多种中草药对临床细菌性皮肤病患犬分离的菌株进行了抑菌试验研究，并对抑菌效果强的单味中药进行了合理组方，以期为临床应用中药治疗细菌性皮肤病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

吉林农业科技学院犬舍所提供。

1.1.2 药品试剂

薄荷，黄芩，防风等中药购于吉林市昌邑区百草堂中药店。

1.2 试验方法

1.2.1 临床症状患犬患病部位掉毛、掉屑，瘙痒，导致患犬将患病部位挠坏或蹭坏，然后形成结痂。

1.2.2 病料采集与致病菌的分离鉴定

1.2.2.1 病料采集：在患犬患病部位消毒、剃毛后，刮取病料，将病料装入消毒过的青霉素瓶中，备用。

1.2.2.2 致病菌的鉴定：在超净工作台上，将病料分别接种到血琼脂培养基和高盐甘露醇琼脂培养基上，恒温箱培养24 h，检查培养情况。根据菌落大小、形状、颜色、透明度和粘度等，初步判断。并挑选若干个可疑菌落分别进行划线，进行纯培养、镜检，根据菌体形态、溶血情况及革兰式染色特性初步判定细菌种属，确定细菌类型。

1.2.3 生化鉴定

使用凝固酶、麦芽糖、甘露醇、V-P试验、透明质酸、耐热核酸酶、马尿酸钠、山梨醇、乳糖、葡萄糖、水杨苷、菊糖、棉子糖、蔗糖等分别配制生化鉴定管。将培养皿中的典型菌种在超净工作台上接种至鉴定管中，并在37 ℃下放置24 h后观察结果。

1.2.4 菌种保存

对已经鉴定完毕的菌株，无菌条件下挑取单个菌落接种至1 mL无菌BHI肉汤，振荡培养16～18 h后，取 新 鲜 菌 液400 µL加 入200 µL灭 菌 的60%甘油混匀，制成20%的甘油菌液，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.5 中药的筛选

1.2.5.1 中药提取：将薄荷、黄芩、防风等19味单味中药各称取50 g，分别加水至200～300 mL，大火开锅后，文火煮30 min。药汁用纱布过滤，保留滤液。滤渣重复上述步骤2次后合并滤液，弃去滤渣。再将合并的滤液文火加热浓缩至50 mL，得到浓缩液1 g/mL。

1.2.5.2 中药药敏纸片的制备：取直径为0.6 cm的灭菌滤纸片在各上述药液中浸泡40 min，取出备用。

1.2.5.3 菌液制备：首先按照血琼脂培养基制作说明制备，在其上接种病原菌，37 ℃条件下培养[4]。用血细胞计数板，将菌液浓度调整为5～6×104个/mL，备用。

1.2.5.4 接种：用微量移液器吸取已经制备好的菌液5 µL，将其均匀于营养琼脂表面，在已涂布好细菌的平皿中放置药敏纸片，每种药物贴四片，然后将平皿置37 ℃恒温箱中培养24 h后测定抑菌圈的大小取其平均值，用抑菌圈大小判定抑菌效果[5]。

1.2.5.5 中药组方抑菌试验：根据单味中药抑菌试验的结果和中医辩证理论，确定中药组方进行试验，方法同上，根据药敏试验抑菌圈大小判定抑菌效果。

2 试验结果

2.1 致病菌的分离鉴定结果

分离出的病原菌在血琼脂培养基和高盐甘露醇琼脂培养基上培养、镜检，视野里有呈菌球形或稍呈椭圆形，排列成葡萄状的，有呈球形或卵圆形，呈链状排列，革兰氏染色为阳性。以显微镜下微观结构为判定标准[6]，疑似葡萄球菌和链球菌。

2.2 生化鉴定结果

对疑似的葡萄球菌和链球菌分别接种于凝固酶、麦芽糖等生化鉴定管，并在37 ℃下放置24 h后观察结果，结果见表1和表2。

表1 病原菌1生化鉴定结果

表2 病原菌2生化鉴定结果

由表1和表2结果可知，病原菌1确认为葡萄球菌，病原菌2确认为链球菌。

2.3 单味中药体外抑菌结果

19味单味中药对葡萄球菌和链球菌分别进行药敏试验，结果见表3。

表3 19味单味中药体外抑菌结果

2.4 中药组方体外抑菌结果

根据表3单味中药抑菌试验的结果和中医辩证理论，确定以下三组中药组方进行试验。

复方中药组一：五倍子、防风、黄芩、姜黄、五倍子、百部、小茴香、蒲公英。

复方中药组二：防风、陈皮、五倍子、姜黄、百部、荆芥、五倍子。

复方中药组三：五倍子、防风、黄芩、黄柏、小茴香、紫苏叶。

所选三种中药组方采用体外抑菌试验，判断其对致病性细菌的抑菌活性，同时根据结果选出最佳组方，结果见表4。由表4可知，三组中药组方对各致病菌都有抑制作用，其中组方一对两种致病菌的抑菌效果均高于其他组方。因此根据数据统计分析，综合各种因素确定组方一为最佳的中药组方，即五倍子、防风、黄芩、姜黄、五倍子、百部、小茴香、蒲公英抑菌效果最好。

表4 中药组方体外抑菌结果

3 分析与讨论

3.1 本试验所选19味中草药，皆是文献记载有抑菌作用的药物，其中一些已多次在皮肤细菌病成方中出现。据高纯一报道，蒲公英葡萄球菌和链球菌均有很强的抗菌作用[7]。

3.2 根据一定的体外抗细菌方法，筛选出具有明显抗细菌作用的中药，尽管不同中药对细菌抑制作用有特异性，且相同中药对各种细菌的抑制作用也有不一致。但以筛选抗细菌中药为前提，还是完成了预期的目标。

3.3 最佳复方中药包含五倍子、防风、黄芩、姜黄、五倍子、百部、小茴香、蒲公英共8味中药，几味药组合，有清热燥湿、祛风止痒、解毒消肿、燥湿敛疮之功效，主治风热湿毒所致的风疹、皮肤瘙痒、疥癣湿疮、痈疽肿毒。既符合中医理论，又适合制成外用制剂，而该组方的临床应用效果如何，其作用机理是什么，还有待进一步研究。