同步硝化反硝化菌（Alcaligenes faecalis WT14）养殖污水脱氮效果研究

陈均利，张树楠，戴桂金，张苗苗*，吴金水，刘锋

（1.中国科学院亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室，长沙农业环境观测研究站，长沙410125；2.湖南省凤凰县农业特色产业中心，湖南 凤凰416200；3.中国科学院大学，北京100049）

水体氮污染已成为世界上最为严峻的环境问题，而生物脱氮是水污染处理中最为经济、有效的处置方法[1]。传统生物脱氮主要包括硝化与反硝化作用。生物硝化与反硝化过程相互依赖，但是由于硝化和反硝化微生物在生理生化上存在巨大差异，所以对溶氧（Dissolved oxygen，DO）、温度、pH、生长速度、化学需氧量（Chemical oxygen demand,COD）以及硝酸盐和亚硝酸盐有着不同的耐受和表现。这使得传统硝化与反硝化过程很难平衡和协调，导致脱氮过程十分复杂，且效率低下[2]。

最近，一类能在好氧条件下进行同步硝化反硝化的新型微生物——异养硝化-好氧反硝化（Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification，HN-AD）菌，受到广泛关注，如PseudomonasAn-1[3]、Klebsiellasp.KSND[4]、Paracoccus denitrificansFJAT - 14899[5]等。HN-AD 菌有着比传统硝化微生物更高的细胞生长速率，并且可以利用有机基质作为碳源，同时能够将不同的形态氮污染物，如氨氮（）、硝态氮（N）和亚硝态氮（）转化为含氮气体[4]。而且，HN-AD 菌在硝化和反硝化过程中的酸碱补偿还可以减少pH 调节成本[6]。一些特殊HN-AD 菌甚至还具备耐受低温、高、低C/N、高有机物和高盐度的特性[4]。这些优势使得HN-AD 菌成为水处理领域的热点。然而，目前对HN-AD 菌生理生化和脱氮性能的研究多通过人工合成废水和摇瓶培养试验，而在实际废水和生物反应器中的脱氮潜力还鲜有报道，因此很难评价HN-AD菌在自然环境条件下的实际脱氮性能[6]。此外，DO 已经被证明是影响HN-AD 菌同步硝化反硝化能力的重要因素，对其氮代谢过程有着重要影响[7]，但是以前研究多集中于某一DO 条件对HNAD 菌脱氮性能的影响[8-9]，而很少研究DO 对HN-AD菌硝化和反硝化活性发挥的影响阈值和具体应用，因此研究DO 控制对生物反应器中HN-AD 菌脱氮效力的影响十分必要。

本研究以长期处理养殖废水的湿地系统分离的一株高效HN-AD 菌（Alcaligenes faecalisWT14）为研究对象，通过氮平衡分析了该菌株的同步硝化反硝化特性，以Boltzmann 模型确定了不同DO 浓度对菌株和去除能力的影响及其DO 抑制阈值，并考察了DO 控制对固定化床反应器中的菌株WT14 脱氮性能的影响。本研究为HN-AD 菌处理高废水提供了新的视角。

1 材料和方法

1.1 微生物菌株、培养基和养殖废水

Alcaligenes faecalisWT14（GenBank No.MN578054）由本实验室从长期处理养殖废水的绿狐尾藻湿地底泥基质中分离，前期已鉴定为一株高效HN-AD 菌株。Luria-Bertani（LB）富集培养基：酵母粉5.00 g·L-1；酶蛋白胨10.0 g·L-1；NaCl 10.0 g·L-1。氨氮培养基：（NH4）2SO40.38 g·L-1、柠檬酸钠4.08 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.05 g·L-1、K2HPO40.2 g·L-1、NaCl 0.12 g·L-1、MnSO4·4H2O 0.01 g·L-1、FeSO40.01 g·L-1、去离子水1 L，pH=7。硝氮培养基：KNO30.72 g·L-1、柠檬酸钠4.08 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.05 g·L-1、K2HPO40.20 g·L-1、NaCl 0.12 g·L-1、MnSO4·4H2O 0.01 g·L-1、FeSO40.01 g·L-1、去离子水1 L，pH=7。氨-硝培养基：（NH4）2SO40.19 g·L-1、KNO30.36 g·L-1、柠檬酸钠4.08 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.05 g· L-1、K2HPO40.20 g·L-1、NaCl 0.12 g·L-1、MnSO4·4H2O 0.01 g·L-1、FeSO40.01 g·L-1、去离子水1 L，pH=7。养殖废水：取自中国科学院长沙环境监测站长期处理养猪废水的绿狐尾藻人工湿地中处理组调节池，进水浓度253～295 mg·L-1，TN浓度261～311 mg·L-1，COD浓度1 088～1 447 mg·L-1。

1.2 氮平衡

将菌株WT14 接种于在100 mL LB 培养基中，在30 ℃、120 r·min-1（DO 5.50 mg·L-1）条件下培养24 h，随后离心（5 000 r·min-1、10 min），用0.9%无菌NaCl溶液悬浮，重复3次（OD600nm=1）备用。

为了分析菌株WT14的氮转化，将1 mL菌悬液分别接种于包含50 mg·L-1的100 mL氨氮培养基和包含25 mg·L-1、25 mg·L-1的氨-硝培养基中，120 r·min-1（DO 5.50 mg·L-1）、30 ℃培养24 h。培养结束收集培养液，HX-IID 超声波细胞破碎仪（沪析，上海）进行超声处理，并用于测定最终的总氮（Total nitrogen，TN）浓度（包括细胞内氮）。接着将培养液8 000 r·min-1离心10 min，上清液过0.22 µm滤膜，滤液用于测定可溶性TN、和[10]。

1.3 DO对菌株WT14脱氨脱硝性能的影响

为了解DO 对菌株WT14 脱氨脱硝能力的影响。将100 mL氨氮培养基和硝氮培养基分别置于250 mL锥形瓶中，和浓度均设置为100 mg·L-1，菌悬液接种量1%（V/V），30 ℃恒温培养24 h，不同DO 培养条件设置如下：0（0.05 mg·L-1）、20（0.85 mg·L-1）、40（1.81 mg·L-1）、60（2.84 mg·L-1）、80（3.85 mg·L-1）、100（4.75 mg·L-1）、120（5.50 mg·L-1）、140（6.08 mg·L-1）、160 r·min-1（6.51 mg·L-1）和180 r·min-1（6.81 mg·L-1），不同转速DO 浓度通过DO 测定仪测定，培养结束取样测定和浓度变化，并计算去除率和去除率。

采用Boltzmann 模型对不同DO 浓度下菌株WT14 的去除率和去除率进行分析，模型公式如下：式中：yN和yD分别为菌株WT14 在DO 浓度为x时的去除率和去除率，%；A1和A2为最低和最高或去除率，%；x为DO 浓度，mg·L-1；xN和xD分别为一半最大去除率和一半最大去除率时的DO 浓度，mg·L-1；dx为时间常数（Time const）。

1.4 养殖废水处理可行性分析

为评价菌株WT14 处理实际养殖废水的可行性。将1 mL 菌悬液接种于装有100 mL 养殖废水的250 mL 三角瓶中，在30 ℃、120 r·min-1（DO 5.50 mg·L-1）条件下培养24 h。每8 h 取10 mL 水样测定、、TN和COD浓度变化。

1.5 菌株WT14在养殖废水处理的应用

为进一步评价Alcaligenes faecalisWT14在实际应用中的可行性，采用直径32.5 cm、高40.0 cm 的透明有机玻璃柱作为固定床反应器，内部填充多孔陶粒作为固定化载体，有效填充高度为34.7 cm（图1）。固定床反应器在30 ℃下运行，通过LZB 玻璃转子空气流量计进行两级DO 控制，使用电子气体流量计（MF5706，MEMS，美国）和DO 测定仪实时监测气体通量和DO 溶度，好氧溶氧浓度（4.00±0.30）mg·L-1，微氧溶氧浓度（0.50±0.10）mg·L-1，水力停留时间为12 h。装填完成后系统先运行7 d进行稳定，再进行30 d定期采样监测，每日采样一次，每次采水样50 mL，测定水样、TN和COD浓度变化。

1.6 分析方法

图1 固定床反应器示意图Figure 1 Schematic diagram of fixed bed reactor

2 结果与讨论

2.1 异养硝化-好氧反硝化性能与氮平衡

如表1 所示，在氨氮培养基中，约92%的氮以气态形式去除，仅有少量的积累（1.21 mg·L-1），其余大部分为胞内氮（2.08 mg·L-1）。而在氨-硝培养基中，WT14 的氮去除率更高，约95%的氮转化为气态氮，且胞内氮浓度更低（0.06 mg·L-1）。这表明菌株WT14 与好氧反硝化菌Hanseniaspora uvarumKPL108相似，具有同化能力[12]。与氨氮培养基相比（1.21 mg·L-1），菌株WT14在氨-硝培养基中有着更低的积累量（0.06 mg·L-1）。在菌株PseudomonasstutzeriT13 中也发现了同样的现象，在和同时存在时会促进好氧反硝化菌对的还原，从而有着更低的积累[13]。

2.2 DO对菌株WT14脱氨脱硝性能的影响

图2 展示了不同DO 浓度对菌株WT14 脱氨脱硝能力的影响。菌株WT14的去除能力与DO浓度有着很好的正相关性，通过Boltzmann 模型进行拟合得到相关性函数公式：yN=94.0+（36.3-94.0）/[1+e（x-2.53）/0.42]（图2），相关系数R2=0.99（P＜0.01），这表示Boltzmann 模型能够很好地解释DO 浓度与菌株WT14去除率的关系。根据该模型，在DO 浓度为2.53 mg·L-1时，WT14 的去除率为最大去除率94.0%的一半（半数抑制浓度）。此外在DO 浓度为3.85 mg·L-1时，菌株WT14 能够达到90%的去除率，高于同等条件下的好氧反硝化菌Ochrobactrum anthropicLJ81[14]和P.chengduensisZPQ2[15]。菌株WT14 的硝化活性虽然受DO 限制，但是其最低去除率依然能达到36.3%（图2），这表明菌株WT14 具有较强的低氧耐受性，在厌氧条件下也有着较好的硝化活性。

图2 不同DO浓度对NH+4-N和去除的影响Figure 2 Effect of different DO concentrations on and removal efficiency

表1 菌株WT14在好氧条件下的氮平衡Table 1 Nitrogen balance of the strain WT14 under aerobic conditions

2.3 菌株WT14处理养殖废水的可行性分析

2.4 不同DO控制方式对养殖废水氮去除的影响

前期DO 影响试验证明菌株WT14 在高DO 条件有着较高的去除率和较低的去除率，且反硝化活性更易受到DO 的抑制，而养殖废水氮去除可行性试验进一步证明WT14 在高DO 条件下处理高浓度养殖废水时其反硝化活性受到抑制，易积累和，从而影响TN 的去除。为维持较高的去除率，同时促进和的还原，基于DO 模型预测WT14 在DO 浓度为4.0 mg·L-1时，有约90%的去除率，在DO 浓度为0.50 mg·L-1时，有约97.7%的去除率，因此建立了两个污水处理系统R1（好氧+好氧）和R2（好氧+微氧）（图1）来明确好氧-微氧控制对TN 去除的促进作用。如图4a 所示，养殖废水进水TN、和COD浓度分别为261～311、253～295 mg·L-1和1 088～1 447 mg·L-1，而和浓度较低，分别为0.60～6.60 mg·L-1和0.50～4.90 mg·L-1。R1和R2反应器出水和COD 浓度相近，分别为0.9～3.0（R1）、0.7～2.1 mg·L-1（R2）和27.0～36.4（R1）、18.2～30.5 mg·L-1（R2），但是两个反应器出水TN 浓度相差较大，分别为27.2～30.9 mg·L-1（R1）和4.8～9.2 mg·L-1（R2）（图4b和图4c）。这主要是由于R1 反应器中（17.5～22.4 mg·L-1）和（2.80～5.70 mg·L-1）的积累，导致其TN 去除率（90.5%）低于R2（97.6%）（图4d）。前期研究结果已经证明高DO 条件（DO 4.00 mg·L-1）有利于菌株WT14 对的去除，硝化活性比反硝化活性更不易受到抑制，因此R1和R2有着相似的去除率（99.3%和99.3%），但是高DO 会抑制WT14 反硝化功能的发挥，从而导致了R1 反应器中和的积累（图4d）。而R2 后续的微氧条件重新激活了WT14 的反硝化活性，从而促进了和的还原，因此R2中有着较低的和积累量。此外，R1和R2反应器的COD 去除率相差不大，分别为97.4%和98.2%，这说明菌株WT14 对COD的去除并不受DO 浓度变化的影响，这与Yan 等[18]的结果一致。

图3 菌株WT14对养殖废水中氮和COD的去除Figure 3 Removal of nitrogen and COD in breeding wastewater by strain WT14

图4 固定床反应器对养殖废水中氮和COD的去除Figure 4 Removal of nitrogen and COD in breeding wastewater from a fixed-bed reactor

异养硝化-好氧反硝化菌有着同步硝化反硝化的天然优势，但是以前研究都过度着重于对的去除，而忽视了TN的去除[19]，如接种Bacillus methylotrophicusL7 的膜生物反应器中的去除率能达到77.5%，但是TN 去除率仅有52.0%[20]；Alcaligenes faecalisNR的去除率为72.4%，而TN去除率为64.2%[21]；Acinetobacter calcoaceticusN7 的去除率为99.2%，而TN 去除率为67.1%[22]。这主要是由于HN-AD 菌的异养硝化和好氧反硝化相关酶对DO 的敏感性不同，这就导致HN-AD 菌在高DO 条件下处理高废水时虽然有着较高的去除率，但是却有着或的积累，从而影响TN 的去除[7]。本次试验通过好氧-微氧两级DO 控制显著改善了这一点，保证去除率的同时，促进了WT14 的反硝化活性，显著提高了TN 去除率，这对HN-AD菌用于处理高废水具有重要意义。

3 结论

（3）好氧-微氧两级DO 控制能够显著提高WT14的TN 去除率，在进水TN、和COD 浓度分别为261～311、253～295 mg·L-1和1 088～1 447 mg·L-1的养殖废水中，平均去除率达到97.6%、99.3%和98.2%，且几乎没有或的积累，这为HN-AD 菌株处理高污染负荷废水提供了参考和借鉴。