多肉植物组织培养中污染现象及预防措施

李浩 罗伟沼 石浩 杨晓莹 王德信

[摘 要] 污染是多肉植物组织培养过程中的常见问题，严重影响了多肉植物的组培成功率。为了提高多肉植物组培苗的成活率，本文对多肉植物组织培养过程中出现的污染及其产生原因进行分析，并提出防止污染使死亡率降至最低的有效方法，为多肉植物组织培养提供技术支持。

[关键词] 多肉植物;组织培养;污染;预防措施

[中图分类号] S682.33 [文献标识码] B [文章编号] 1674-7909（2020）21-96-2

随着经济的发展及医疗保健业的进步，人们越来越向往高质量的生活，并出现了回归自然的潮流，人们越来越热衷养花来陶冶情操、缓解压力。多肉植物是指某些营养器官具有发达的薄壁组织可以贮藏大量的水分，在形态结构上肥厚多汁的一类植物。多肉植物品种繁多、管理简单、抗逆性强、颜色丰富、造型各异、易种植以及对土壤要求不高，并具有良好的空气净化功能。此外，多肉植物浇水少，属于典型的懒人植物，近年来逐渐成为深受广大消费者喜爱的景观植物。但是，多肉植物在长期栽培过程中存在质量退化现象，珍贵的多肉植物成活率低、成本高;在自然条件下，短时间内繁殖非常困难。通过组织培养技术可有效解决上述问题。利用多肉植物叶片、茎尖等作为外植体，通过诱导愈伤组织、丛生芽分化、生根和无菌苗移栽等多个步骤建立高效的快速繁殖体系，能有效加快多肉植物繁殖的工厂化进程。但在多肉植物组织培养过程中，无菌苗经常会出现污染现象，严重影响多肉植物组织培养效果。本文积极探讨多肉植物组织培养中污染产生的因素，探寻预防策略，为多肉植物组织培养提供技术支持。

1 多肉植物组织培养中污染现象及其产生的原因

污染是在组织培养过程中，由于试验材料、环境等灭菌不彻底等原因，使细菌、微生物混入培养基中，从而产生细菌或者霉菌导致培养失败的现象。因此，必须严格操作植物组织培养的每一步，将细菌、霉菌等微生物扼杀在摇篮里。

多肉植物组织培养污染现象主要由细菌和真菌造成的。细菌性污染是影响多肉植物组培的一种最主要因素，细菌种类主要是芽孢杆菌属[1]，其次是假单胞菌属，细菌体积小，传播途径多样化，往往发生于接种早期，7 d内即可显现出来，并且极易扩散，在培养材料周围表现出水渍状、斑块状，造成很多植物材料坏死。细菌来源主要为植物材料和接种用具等。真菌污染主要是霉菌（青霉菌为主）[2]，受真菌污染后多肉植物材料很快变黑，一般7 d左右能看到绒毛状或者絮状菌丝，菌落较大，多呈黑色。

污染的原因主要有以下几个方面。一是培养基出现污染。培养基是植物离体培养组织赖以生存的营养基质，是植物组织培养提供营养物质的重要来源。培养基成分中含有重要的营养物，主要包括大量元素及微量元素。在培养基灭菌过程中，其中任何一种营养物质氧化或者灭菌不充分（压力过大或过小、灭菌时间较短等）都会导致培养基遭到污染。二是仪器、用具出现污染。在接种过程中用到的试验仪器和试验用具，如镊子、剪刀、滤纸等，如果携带大量细菌，而且没有进行高温灭菌或灭菌不彻底，那么会导致微生物残留、细菌增生。三是无菌操作技术不规范[3]。无菌操作不规范会将大量微生物带入培养基，进而导致外植体被污染，最终无菌苗出现大面积污染。四是没有严格进行消毒灭菌。在组织培养过程中没有按照正确的操作步骤进行消毒灭菌，漏掉其中的任一环节都会导致植物体残留大量细菌。五是外植体灭菌不彻底。组织培养工作中最重要的一个环节是外植体灭菌，多肉植物茎叶中含有大量水分，如果灭菌不充分，培养过程中大量水分外泄，易滋生细菌，导致材料污染。

2 多肉植物组织培养污染现象的预防措施

在组织培养过程中严格控制无菌接种操作的每个环节，是控制组培污染的重要措施。无菌操作直接影响培养材料及培养基的污染率[4]，是组织培养控制污染的关键过程。针对以上污染产生的原因，在多肉植物组织培养过程中应注意以下几点。

2.1 所用试剂与主要用具严格消毒灭菌

试验过程中用到的培养基需进行严格的高压蒸汽灭菌，较长时间不用可以放在4 ℃冰箱储存备用。接种用的镊子、剪刀、接种瓶、滤纸和培养皿等使用用具也需进行高压蒸汽灭菌，一般121 ℃灭菌20 min效果较好。激素类试剂适合选用抽滤灭菌方式，一般用0.22 μm滤头抽滤灭菌。

2.2 选择合适试验材料

多肉组织培养工作的第一步是选择合适的外植体，外植体种类直接影响组织培养的效果。多肉组织培养中叶片常常被选择作为外植体，但是如果选择雨天取材，往往细菌较多。晴天取材，由于阳光紫外线照射，具有一定杀菌效果，材料带菌相对较少。因此，选择外植体时，应选择生长旺盛部位，并在晴天取材[5]，以保证多肉植物组培效果佳。

2.3 选择适宜的灭菌方式

由于多肉植物暴露在自然环境中，外植体会携带大量细菌。此外，多肉植物叶片多绒毛，不易灭菌，因此多肉植物外植体灭菌消毒一定要严格按照操作步骤进行。多肉植物外植体灭菌应采用流水冲洗、洗衣粉浸泡、升汞及酒精消杀等方法，时间相对一般植物要长。具体操作为先将外植体用蒸馏水冲洗20～30 min，将洗衣粉放入盛有蒸馏水的烧杯中，搅拌并使其充分混匀，之后将多肉植物放到烧杯中，浸泡20 min;再轻轻搓洗叶片，用蒸馏水冲洗20～30 min，用0.1%升汞溶液浸泡10～15 min、75%酒精浸泡20 s，最后用无菌水冲洗3～5次，放入已灭菌的培养皿中的滤纸上吸水备用。这种灭菌方式效果佳。

2.4 严格实施标准化无菌操作

无菌操作人员要自身做到尽量少带菌，试验前穿隔离衣，用水和肥皂洗净双手，裸露手臂部位喷75%酒精，再进入无菌操作室。无菌操作前，将双手再用75%酒精喷雾消毒，将解剖刀、剪刀、镊子等金属试验工具用95%乙醇浸泡消毒，用乙醇灯外焰灼烧灭菌，后置于支架上冷却备用;操作过程中动作要迅速快捷，尽量减少培养材料及器皿、工具等在空气中的暴露时间;燃烧的酒精灯附近微生物无法存活，相对安全性高，操作以靠近酒精灯为宜。同时，在无菌操作过程中，一定避免外部无关人员进出，可有效降低污染概率。

2.5 嚴格试验环境及试验场所灭菌

必须将无菌接种间、培养室等房间进行高锰酸钾、甲醛熏蒸或喷雾灭菌。超净工作台需要进行紫外杀菌消毒20 min以上。如果用光照培养箱或者人工气候室进行培养，也需要用75%酒精进行全面杀菌消毒。

培养室的温度、湿度与污染率密切相关，高温高湿适合细菌生长，造成杂菌生长，所以污染率高;空气干燥不利于细菌繁殖，污染率低。因此，在多肉植物组织培养过程中应适当降低培养室湿度，以有效降低污染率。

3 结语

多肉植物组织培养是有效解决多肉植物快速繁殖的重要技术，不仅有利于多肉植物的大规模生产，而且可有效保护多肉植物物种的多样性。但由于多肉植物组织含水量高，茎叶生长绒毛，在组织培养过程中操作不慎易造成严重污染，克服污染成为多肉植物组织培养中的关键技术。完善多肉植物组培技术，建立针对不同科属多肉植物的组培方案，优化多肉植物组培快繁体系，降低污染率，提高多肉植物组培效率及成功率，才能更好地造福人类。

参考文献

[1]方丽，王连平，茹水江，等.植物组培过程中污染微生物种类及其季节性的变化[J].浙江农业学报，2013（2）：86-89.

[2]王洪波，郝会军，丁雪珍，等.组培环境中污染菌种类初探[J].潍坊高等职业教育，2007（1）：43-45.

[3]朱小虎，王晓炜，米立刚.植物组织培养中存在的问题及改进方法[J].新疆农业科学，2006（s1）：95-98.

[4]赵佐敏，艾勇.植物组织培养过程中的污染原因及控制措施[J].贵州农业科学，2004（1）：61-62.

[5]纪纯阳，矫丽曼，刘巍，等.植物组织培养中污染产生的原因及防止措施[J].辽宁林业科技，2011（2）：43-47.

基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目（201710455124）;山东省重点研发计划项目（2019GNC106113）;山东省高等学校青创科技支持计划;菏泽学院现代农业研究中心。

作者简介：李浩（1997—），男，专科在读，研究方向：植物组织培养。

通信作者：王德信（1975—），男，博士，副教授，研究方向：植物基因功能。