桔梗组织培养存在的问题及对策

冯淑月 黄玥明 张伟 王士杰

[摘 要] 本文对桔梗组织培养技术研究现状及存在的关键性技术问题展开综述，针对褐化因素、污染、玻璃化等影响组培效果的主要问题给出相应解决措施，以期为桔梗组织培养规模化生产提供理论基础。

[关键词] 桔梗;组织培养;褐变;污染

[中图分类号] S567.239 [文献标识码] B [文章编号] 1674-7909（2020）21-94-2

桔梗（Platycodon grandiflorum）又名六角荷、铃铛花等，其根可入药，为桔梗科多年生草本植物，是我国常用的重要中药材，主产于我国东北、华北、华东、华中等地区，在世界各个地区均广泛种植[1]。植物组织培养技术指的是基于植物细胞全能性进行植物培育研究的一种技术[2]。目前，桔梗组织培养中存在诸多因素影响桔梗愈伤组培诱导和培养，且存在易褐化、玻璃化等问题，同时污染问题是影响桔梗组培效果的主要因素，亟待优化上述问题。

1 桔梗组织培养外植体选择及过程

1.1 桔梗组织培养外植体的选择

桔梗的外植体选择对后续试验的有序进行有重要影响。桔梗外植体不同生理部位和生理状态的不同，诱导效果和诱导出愈伤组织的诱导率也不同。采用桔梗叶片、茎段和根作为外植体，后续培养过程中均具有诱导出愈伤组织且发育成苗的能力。严一字等采用无菌苗的叶片、茎段和根段作为试验材料，培养时均能诱导出愈伤组织，还发现不同外植体在诱导培养阶段最佳诱导培养基的配比不同[3]。诱导阶段选用叶、茎段和上胚轴作为外植体比较发现，上胚轴作为外植体可以缩短诱导时间，且可以简化培养基。

1.2 桔梗组织培养过程

1.2.1 初代培养。目前，植物组织培养中最常见的培养基有MS、B5、White、N6、WPM和Anderson等种类。研究表明，以叶片作为外植体时选用N6培养基可以直接诱导出苗，效果最好，茎段为外植体时选用MS培养基效果最好。曲生娇在诱导丛生芽阶段以带叶节茎段、叶片作为外植体，利用MS基本培养基并添加0.3 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA[4]。王桂梅等以桔梗茎段作为外植体，附加不同浓度的6-BA和NAA，得出最佳诱导桔梗外愈伤组织的配方为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5mg/L[5]。较高浓度的6-BA有利于愈伤组织的形成，但浓度过高会诱导腋芽形成簇状分生组织，影响小苗的形成速度。

1.2.2 继代培养。继代培养的基本培养基与初代诱导培养及类型基本一致，但目的不同。秦梅等在增值培养时发现6-BA浓度过高或过低均会抑制侧芽的萌发，影响继代材料的扩大[6]。张燕等在桔梗丛芽增值试验时，使NAA浓度相同，随着6-BA浓度的增加，小苗的增值倍数也增加，说明6-BA对桔梗继代诱导起促进作用[7]。继代培养时，发现随着NAA浓度增加，丛生芽的增值倍数呈现负相关。

1.2.3 生根培养。桔梗的组培苗不添加外源激素均能生根，但根和苗的长势均较弱。在桔梗生根培养时，随着NAA浓度的升高生根数和生根率均会升高，但NAA浓度过高时，生根时间会延长，生根数、生根率均会降低。

2 桔梗组织培养中存在的问题

2.1 褐变现象

褐变又称“褐化”，是指培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐褐变，培养材料随之褐变甚至死亡的现象。桔梗组织培养引起褐化的主要机理是酶促反应[8]，造成褐变的原因有很多，主要包括植物的种类和基因型、外植体的类型和生理状态、外植体的大小和采樣时间、培养条件和培养基成分等。

2.2 污染现象

污染是指在植物组织培养过程中，由于真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器中滋生大量的菌斑，导致培养材料不能正常生长发育的现象[9]。在桔梗的组织培养过程中，污染常有发生，造成污染的原因有很多。例如，器具消毒不彻底，外植体灭菌不彻底，接种操作不当，接种环境不干净，超净工作台区域被污染，外植体材料内部消毒不彻底等均会引发污染，以上因素均是组织培养过程中较难控制的问题。

2.3 玻璃化现象

玻璃化是指在培养过程中培养材料呈半透明状态，结构组织发育成畸形的现象。玻璃化现象一般出现在继代培养过程中。细胞分裂素浓度过高，细胞分裂素与生产素相对含量高，培养基中离子种类比例不适、琼脂和蔗糖浓度过低，培养条件不适宜，如不良培养环境、温度过高、光照时间不足和通气不良等因素均会引起玻璃化现象。

3 解决桔梗组织培养问题的有效措施

3.1 褐变防治措施

首先，桔梗组织培养过程中，选择外植体时，生长季节植物体内的酚类化合物较多，所以尽量选择在早春或者晚春取材，一般选择幼龄植株嫩茎作为外植体。外植体切口越大越容易发生褐化，外植体选材宜大不宜小，外植体切口宜小不宜大。其次，培养材料预处理时，要采用流水冲洗，在5 ℃左右处理12～24 h，消毒后接种在只含有蔗糖的培养基上5～7 d，使外植体中的酚类物质部分渗透到培养基中。取出外植体，用科学的方法清洗干净，再接种到适当的培养基中，可在一定程度上避免外植体褐化。其次，培养基应选择适当的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平与组合以及添加一些抗褐变剂，可减轻褐变的发生。添加抑制剂、吸附剂、活性炭、抗坏血酸可有效减轻组织培养过程中的酶促褐化现象。加入抗坏血酸的培养基发生褐变的概率小于不加的培养基。柠檬酸等也能够有效避免或减轻褐变现象。培养初期应严格控制培养条件，采用低温（15～20 ℃）、黑暗、弱光环境，可有效防止高光和高温引起褐化。对容易发生褐变的材料可间隔12～24 h再转瓶培养，这样连续处理7～10 d后，褐变现象会得到一定程度的控制。

3.2 污染防治措施

首先，进行组培室的消毒灭菌。保证组培接种室无菌、干净、整洁，能够有效防止污染。每周对组培室进行一次大扫除和彻底的消毒灭菌;接种室和培养室要求密闭、干燥、保持与外界环境相对隔绝的状态，减少与外界的空气对流及微生物与尘埃的浸入，严格控制光照、温度、湿度、空气等各种生态因子。其次，加强培养容器和培养基的消毒灭菌处理。培养瓶、试管等容器和封口用的盖子、耐高温的塑料膜等物品在用前均要经过彻底清洗、晾干。配制好的培养基分装后应立即高压蒸汽灭菌，放置两三天，等到培养基表面和内部无杂菌污染的情况下可认为灭菌彻底，进行接种工作。再次，注意无菌操作。接种工作人员应严格按照无菌操作要求，规范熟练地进行每一步操作，可减少操作不当引起的污染。最后，清除污染传播源。组织培养过程中污染是不可避免的，一旦发现培养污染物，应及时处理污染培养瓶，把污染物从培养室转移出去，再对污染物进行高压灭菌消毒，清洗干净待用[10]。

3.3 玻璃化防治措施

选择外植体时，优先考虑不易玻璃化的基因型及部位，选择有助于降低玻璃化的顶芽作为外植体[11]。配制培养基时，添加外源生长调节剂如IAA、GA3、ABA，可减小玻璃化苗的出现。降低铵态氮浓度的同时提高硝态氮的含量，在大规模生产中成效显著。适当调整琼脂浓度也可防止玻璃化的产生。添加有机物根皮苷、添加植物生长调节剂合成前体，如ACC，或添加适宜浓度的活性炭，均可有效抑制组培苗玻璃化的形成。改善培养条件，尽量采取光照培养，在适宜的光照时间内适当提高光照强度;确定桔梗材料的适宜培养温度范围;选择适宜的湿度条件;适当的通风降低培养容器中的湿度等，均有利于防止组培苗玻璃化现象发生。

4 结语

目前，药用植物组织培养存在诸多不可调控因素，如培养条件、生长因子、污染原因、褐化现象和玻璃化因素等。目前，桔梗组织培养也仅限于试验研究，不利于大规模化生产。在科技迅速发展的今天，随着植物生理学、生物化学、组织培养学、植物学等学科的不断渗透及各方研究的不断合作，将会逐步解决组织培养技术中的难题，避免不可控因素的出现，保证组培效果。

参考文献

[1]韩蕊，李爽，杨柳，等.桔梗组织培养技术研究进展[J].人参研究，2018（2）：48-51.

[2]张东旭，周增产，卜云龙，等.植物组织培养技术应用研究进展[J].北方园艺，2011（6）：209-213.

[3]吴京姬，吴基日，严一字，等.培养基组成对桔梗组织培养的影响[J].延边大学农学学报，2006（1）：18-23.

[4]曲生嬌.桔梗组织培养研究[D].吉林：吉林农业大学，2012.

[5]王桂梅，贺美忠，杨富.桔梗组织培养技术的研究[J].安徽农学通报，2012（7）：70-71.

[6]秦梅，关文林，段玮屏，等.桔梗茎段的组织培养及植株再生[J].云南农业，2004（8）：8.

[7]张燕，黎斌，张莹，等.桔梗植株再生体系的建立及试管内开花现象[J].陕西农业科学，2015（10）：18-22，39.

[8]王栋，玉永雄，胡艳，等.植物组织培养中的褐化现象及其防止措施[J].黑龙江农业科学，2008（1）：7-10.

[9]温璐华，武瑞娜.植物组培内生菌污染的防治措施[J].防护林科技，2020（2）：83-85.

[10]刘文静.植物组织培养中常见污染类型及防控技术探讨[J].南方农业，2019（Z1）：130-131.

[11]李娅莉，张健，潘远智.观赏植物组织培养过程中玻璃化现象与解决措施进展[J].四川农业大学学报，2004（3）：278-282.

基金项目：吉林农业科技学院大学生科技创新项目“桔梗的组织培养及抗盐碱性研究”（2019007）。

作者简介：冯淑月（1995—），女，本科在读，研究方向：中草药栽培与鉴定。

通信作者：王士杰（1978—），男，博士，副教授，研究方向：中草药栽培与加工。