香蕉条斑病毒病和花叶病混合感染的症状及其分子检测①

王艳玮 漆艳香 曾凡云 张 欣 谢艺贤 彭 军

(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 海南海口571101)

香蕉条斑病毒（Banana streak virus，BSV）和香蕉花叶心腐病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是危害中国香蕉的2 种重要病毒，植株染病后矮缩甚至死亡，造成果实品质和产量严重下降。香蕉主要通过组培技术进行无性繁殖， 种苗一旦带毒，将加剧香蕉病毒的传播和危害。

香蕉条斑病毒是香蕉上的一种重要病毒。BSV属于杆状病毒属（Badnavirus），含有7.2～7.8 kb的双链环状DNA（dsDNA）编码3 个ORFs［1］。ORF1编码功能未确定的小分子蛋白，可能与病毒粒子形成相关；ORF2 编码一个大约14 ku 的蛋白，含有N 末端Coiled-coil 功能域，推测与病毒粒子组装相关；ORF3 编码一个复合蛋白，该蛋白通过剪切作用产生病毒外壳蛋白（Coat Protein， CP）、天冬氨酸酶（Aspartic Protease， AP）、反转录酶（Reverse Transcriptase， RT）、核糖核酸酶H（RNase H， RH）以及移动蛋白（Movement Protein， MP）等。BSV 具有整合进入香蕉基因组的特性。当香蕉受到外部环境胁迫，BSV 整合香蕉基因组的BSV，使其成为内源BSV（endogenous BSV，eBSV）游离出来独立于染色体外，成为游离BSV（episomal BSV），从而使香蕉植株表现出染病症状［2］。据报道，近年来中国广东、云南、海南等香蕉主要种植地区先后有香蕉条斑病发生，该病早期症状表现为米粒状的褪绿，随着症状的发展，叶片出现断续或连续的褪绿条斑及梭形条斑，并可逐渐发展成坏死黑色条斑，假茎、叶柄及果穗有时也会出现条纹症状［3-4］。

香蕉花叶病是由黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）引起的一种病毒病，被该病毒侵染的香蕉会出现植株矮化的症状，且与正常植株对比，该病株的叶片会有浓绿镶嵌的斑驳、花叶状条纹或褪绿的梭状斑，严重者嫩叶出现严重黄化或斑驳，直到变褐腐烂［5］。

为调查海南省BSV 和CMV 的发生情况，在2019年12 月份海南持续低温的一周内对几个主要香蕉种植园进行调查，为后续香蕉病毒病的防治以及健康组培苗的监测提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疑似病株

随机采集海南澄迈、陵水部分香蕉种植园具BSV、CMV 疑似症状的病株，带回实验室保存，将经PCR 检测、测序后确定有CMV、BSV 感染的香蕉植株作为阳性对照（+CK）， 健康香蕉植株作为阴性对照（-CK）。

1.1.2 试剂

TaqDNA 聚合酶等购自大连宝生物工程（Ta-KaRa）有限公司，引物由上海生物工程公司合成（HPLC 纯化），RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒等购自TIANGEN 有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据BSV 的ORF3 基因组序列设计BSV-P1/P2 特异性检测引物（表1），可以扩增出eBSV/BSV 2 种形式的BSV［6］。根据CMV 外壳蛋白基因序列，通过比较多个株系之间的保守序列设计引物［7］。

表1 CMV 和BSV 引物序列

1.2.2 总RNA 的提取及cDNA合成

取0.1 g 的香蕉疑似样品的叶片，用液氮充分研磨成细粉状，收集至2 mL 离心管中并做好样品标记。按照RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的操作说明提取病叶RNA；用1%的琼脂糖凝胶电泳检测纯度，Nanadrop 测定OD260/280，于-80℃条件下保存备用。

采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒，将提取到的总RNA 反转录合成cDNA，再将cDNA 溶液放置于-20 ℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增验证

分别对BSV cDNA 和CMV cDNA 进行PCR 扩增，反应体系为50 μL（2×Taq mix 25.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，模板cDNA 2.0 μL，H2O 21.0 μL）；PCR 扩 增 条 件：94 ℃预 变 性5 min，95 ℃变性15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延长1 min ，进行35 次循环，72 ℃延长5 min ，16 ℃降温5 min。取10 μL PCR 反应产物，用1%琼脂糖凝胶进行电泳验证。

2 结果与分析

2.1 田间观察结果

田间观察发现，部分田间香蕉叶片具断续或连续的褪绿条斑，甚至部分叶片叶脉枯死，这些是BSV典型症状；而其他叶片出现棱形或不规则花叶斑驳状，为典型CMV症状。部分香蕉植株顶部叶片有明显的花叶状斑纹，而下部的叶片则呈现褪绿条斑状（图1），分别与CMV 和BSV 的病毒症状一致，初步判断为CMV和BSV混合感染。

2.2 BSV和CMV的PCR检测

2.2.1 BSV检测结果

PCR 扩增电泳结果中出现了2条亮度明显的条带，第一条带位于1 000 bp 附近位置，第二条则在500～750 bp。与+CK 比对可知，第一条带为目的片段，第二条带则是整合到基因组的eBSV 扩增条带。结果表明疑似症状香蕉植株都携带BSV，由于低温胁迫，eBSV 游离出来，形成未整合到基因组、独立于染色体外的游离BSV（episomal BSV），从而使香蕉植株表现出染病症状（图2）。

2.2.2 CMV RT-PCR检测结果

在BSV 检测呈阳性的样品中，随机选择10 个样片提取RNA 后经反转录合成cDNA 后，CMV 扩增电泳结果显示，扩增条带与+CK 条带对比完全一致，测序结果进一步验证了疑似病株中的确存在香蕉花叶心腐病感染（图3）。

3 讨论

香蕉病毒病是限制香蕉产业健康发展的重要因素之一，不同病毒间可能会存在混合感染的现象，前期通过田间调查及分子检测发现，在云南、海南、广东等地区普遍存在BBTV 和CMV 混合感染的现象［7-8］。近年来由于未对香蕉条斑病毒进行严格检疫，香蕉条斑病在华南地区的发生十分普遍。香蕉条斑病的症状与香蕉花叶病症状比较接近，且症状表现受到温度的影响，因此难以根据症状进行准确判断，给检测造成了一定的困难。利用海南低温天气开展的田间症状调查显示，具BSV、CMV 疑似症状的样品大部分含有整合到基因组的eBSV和游离的BSV。此外，大部分感病香蕉植株的顶端叶片出现典型的CMV症状，而下部叶片出现典型的BSV 症状，随机对部分BSV 阳性样品进行CMV RT-PCR 检测发现，此部分香蕉植株存在BSV 和CMV混合感染。后续随着气温的升高以及香蕉的健康生长，BSV症状基本消失。

对于病毒病的防治，首先加强种苗的监测和检测，保证无毒香蕉苗是控制该病的主要措施之一。香蕉无毒种苗主要通过组培工厂产业化生产，一旦种苗带毒，病毒随种苗扩繁将加剧香蕉病毒的传播和危害。其次，当香蕉受到低温胁迫时，会呈现更为明显的香蕉条斑病毒症状。因此，在香蕉生长过程中注意观察症状，并结合PCR检测技术，防止种苗携带BSV病毒而造成严重危害。