尿石素A预处理对肝缺血再灌注损伤大鼠模型的保护作用

米 凯， 黄 锐

1 核工业四一六医院(成都医学院第二附属医院) 普外科， 成都 610500；2 四川省人民医院 肝胆外科， 成都 610007

在进行肝脏手术的过程中，肝脏往往因缺血再灌注造成损伤，这被认为是手术失败的主要原因之一[1]。近年来，由于晚期肝病患者逐年增多，导致需要进行肝脏手术的人数大幅上涨，因此，寻找预防或治疗肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)的药物尤为重要。

尿石素A(Urolithin A，Uro-A)是鞣花酸被肠道微生物代谢后生成的一种物质[2]。鞣花酸存在于多种坚果、浆果和石榴中，是一种多酚物质[3]。有研究[4]证实Uro-A具有降低血浆中炎症因子、减少细胞炎症反应并抑制细胞凋亡的作用，且比其前体鞣花酸效果更显著。Uro-A能减轻脑神经炎症与损伤[5]，在肾脏缺血再灌注中发挥预防与治疗作用[6]，亦能减轻其他疾病的炎症反应[7]。但其在预HIRI方面目前未见相关报道，因此本实验从控制内质网应激与细胞凋亡方面探讨Uro-A对HIRI的预防与治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，平均体质量(260±20)g，由成都达硕实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(川)2015-030，使用许可证号：SYXK(川)2014-189。

1.1.2 实验药物 Uro-A，纯度≥98%，购于上海甄准生物有限公司(批号：20190203)。

1.1.3 实验试剂 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所，IL-1β、IL-6、TNFα、TUNEL测定试剂盒购于武汉博士德生物公司，CHOP、GRP78、Caspase-12、β-actin和羊抗兔二抗均购于abcam公司。

1.1.4 实验仪器 全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司)、切片机(德国徕卡公司)、酶标仪(美国Thermo公司)、光学显微镜(日本Olympus公司)、全功能成像仪(美国Bio-Rad公司)、蛋白质电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及构建大鼠HIRI模型[8]将40只大鼠按随机数法随机分成4组，即假手术组、模型组、Uro-A低剂量组(1 mg/kg)与Uro-A高剂量组(3 mg/kg)，每组10只。Uro-A低、高剂量组手术前分别灌胃溶于生理盐水的对应药物，模型组与假手术组灌胃等体积生理盐水，持续5 d，1次/d。最后1天预处理完毕后1 h，腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)，在上腹正中打开腹腔，小心暴露肝脏，然后游离肝周韧带。模型组与Uro-A低、高剂量组夹闭肝左叶和肝中叶入肝血管阻断血流，60 min后松开血管夹恢复血流。假手术组仅游离肝门而不阻断血流。再灌注6 h后，收集下腔静脉血液用于生化指标检测；分离部分肝脏组织于-80 ℃储存，用于炎症因子、氧化应激因子和相关凋亡蛋白的检测；剩余肝脏组织储存在4%多聚甲醇中进行固定，用于病理学检测。

1.2.2 血清ALT、AST、乳酸脱氢酶(LDH)检测 将下腔静脉血以3000 r/min离心10 min，取上层血清，按照试剂盒说明书进行操作，使用全自动血液生化仪测定各组血清中AST、ALT和LDH水平。

1.2.3 肝脏中IL-1β、IL-6、TNFα检测 将肝组织制备10%的组织匀浆，3000 r/min离心10 min，取上清液按照ELISA试剂盒说明书进行操作，使用全自动酶标仪测定肝脏中IL-1β、IL-6、TNFα含量。

1.2.4 肝脏中SOD、MDA、CAT检测 取肝组织制备10%的组织匀浆，3000 r/min离心10 min，取上清液按照试剂盒说明书进行操作，使用全自动酶标仪测定肝脏中SOD、MDA、CAT含量。

1.2.5 肝脏病理学分析 所有组织病理学检查均由对研究组不知情的研究人员进行。将固定好的各组肝脏标本用石蜡包埋，切片后行HE染色，使用光学显微镜在200倍放大下进行病理学分析，评价肝脏组织被膜、肝索、核膜等损伤情况。

1.2.6 肝细胞凋亡率计算 各组肝脏标本用石蜡包埋切片后，按照TUNEL染色试剂盒说明书进行染色操作，使用荧光显微镜观察细胞凋亡情况，每例标本的切片随机选取5个400倍视野，按每100个细胞中含凋亡细胞数计算细胞凋亡率。

1.2.7 Western Blot检测各组大鼠肝脏调亡蛋白情况 提取肝脏的总蛋白同时测定蛋白浓度。蛋白样品(20 μg)在10% SDS-PAGE凝胶进行电泳，然后转移至PVDF膜，转膜完成后室温下用5%脱脂奶粉封闭60 min，4 ℃过夜孵育下列一抗：兔抗大鼠下游应激转录因子(CHOP)(1∶1000)、兔抗大鼠葡萄糖调节蛋白78(GRP78)(1∶1000)、兔抗大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-12(Caspase-12)(1∶1000)、兔抗大鼠β-actin(1∶1000)。使用TBST将膜清洗干净后在羊抗兔IgG(1∶10 000)中室温孵育2 h，最后使用ECL试剂盒曝光显影，在凝胶成像系统下对条带进行分析。

1.3 伦理学审查 本研究方案经由四川大学华西医院实验动物伦理委员会审批(批号：2020163A)，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 Uro-A预处理对大鼠肝脏功能的保护作用 与假手术组相比，模型组与Uro-A低、高剂量组大鼠血清ALT、AST与LDH水平显著升高(P值均<0.01)；与模型组相比，Uro-A低、高剂量组ALT、AST与LDH水平显著降低(P值均<0.05)；与Uro-A低剂量组相比，高剂量组ALT、AST与LDH水平显著降低(P值均<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠血清ALT、AST、LDH水平比较

2.2 Uro-A预处理对大鼠炎症因子的影响 与假手术组相比，模型组大鼠肝脏中IL-1β、IL-6、TNFα水平明显升高(P值均<0.01)；与模型组相比，Uro-A高剂量组大鼠肝脏中的IL-1β、IL-6、TNFα水平显著降低，Uro-A低剂量组大鼠肝脏中仅TNFα水平显著降低，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠肝脏中IL-1β、IL-6、TNFα水平比较

2.3 Uro-A预处理对大鼠肝脏氧化应激因子的影响 与假手术组相比，模型组大鼠肝脏中SOD含量降低，MDA与CAT含量升高，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；与模型组相比，Uro-A低、高剂量组SOD含量明显升高(P值均<0.01)，Uro-A高剂量组MDA与CAT含量显著降低(P值均<0.01)(表3)。

表3 各组大鼠肝脏中SOD、MDA、CAT水平比较

2.4 Uro-A预处理对大鼠肝脏形态学的影响 光镜下观察发现，假手术组肝脏被膜完整，肝索排列较为整齐；肝细胞形态正常，胞质染色均匀，核膜完整；肝窦无明显扩张、淤血及炎细胞浸润；门管区结构完整，小叶间动脉、静脉、胆管结构完整清晰，未见明显的纤维组织增生及炎性渗出(图1a)。模型组肝脏被膜完整，肝索排列较为紊乱；大量肝细胞气球样变，可见细胞严重肿胀，体积明显变大，胞质染色明显变浅或几乎透明，呈“气球样”，胞核位于中央或被挤于一侧；少量肝细胞坏死，胞核固缩；肝窦无明显扩张、淤血及炎细胞浸润；门管区静脉内皮细胞少量脱落，门管区周围可见较多中性粒细胞浸润，阳性率达90%(图1b)。Uro-A低剂量组肝脏被膜完整，肝索排列较为整齐；肝细胞空泡变性，部分细胞肿胀明显；肝窦无明显扩张、淤血及炎细胞浸润；门管区周围少量肝细胞呈点状坏死并伴少量淋巴细胞浸润，阴性率达80%(图1c)。Uro-A高剂量组肝脏被膜完整，肝索排列较为整齐；肝细胞空泡变性，部分细胞轻微肿胀，偶见少量肝细胞呈点状坏死；肝窦无明显扩张、淤血及炎细胞浸润；门管区结构完整，小叶间动脉、小叶间静脉、小叶间胆管结构完整清晰，未见明显的纤维组织增生及炎性渗出(图1d)。

2.5 Uro-A预处理对大鼠肝脏细胞凋亡的影响 荧光显微镜下观察发现，假手术组细胞核多数呈蓝色，细胞结构完好，凋亡细胞少(图2a)；模型组大部分细胞核呈黄色，细胞结构被破坏，凋亡细胞大量生成(图2b)；Uro-A低剂量和高剂量组细胞核大部分呈蓝色，部分细胞核呈黄色(图2c、d)。与假手术组相比，模型组肝脏细胞凋亡率显著升高(P<0.01)；与模型组相比，Uro-A低、高剂量组肝脏细胞凋亡率显著降低(P值均<0.01)；与Uro-A低剂量组相比，Uro-A高剂量组细胞凋亡率亦明显下降(P<0.05)(表4)。

表4 各组大鼠肝细胞凋亡率比较

2.6 Uro-A预处理对大鼠肝脏凋亡蛋白的影响 蛋白检测结果显示，与假手术组相比，模型组中CHOP、GRP78和Caspase-12表达均明显增多(P值均<0.01)；与模型组相比，Uro-A高剂量组中CHOP、GRP78和Caspase-12表达均显著下降(P值均<0.05)(表5，图3)。

表5 各组大鼠肝脏中CHOP、GRP78、Caspase-12水平比较

3 讨论

本研究的主要目的是探讨Uro-A对HIRI的预防效果，笔者在Cui等[9]使用Uro-A治疗大鼠动脉粥样硬化的基础上，选取了1 mg/kg和3 mg/kg两个浓度进行实验。Uro-A是一种鞣花酸代谢产物，口服进入体内后需要消化代谢后才能发挥药效。口服Uro-A经尿液排出体外的含量很少，经过胃-十二指肠-小肠的代谢吸收后，会运输到肝脏储存，而且不会对胃肠道产生不良反应[10]，这为评价Uro-A的预防作用提供了天然的条件，结合中药成分的吸收速度，本研究选用术前连续灌胃5 d Uro-A作为给药方式。

肝功能检测是评价HIRI模型是否构建成功的方法之一。本实验在夹闭大鼠肝左叶与中叶血管后，通过肉眼观察肝脏组织发现，肝脏呈暗红色，证明已经造成肝脏缺血。能够反映肝损伤的指标包括血清ALT、AST与LDH含量，损伤后血清中ALT和AST水平异常升高[11]，LDH能侧面反映肝细胞的受损程度[12]。本实验结果发现，模型组ALT、AST、LDH水平较假手术组显著性升高(P值均<0.01)，说明大鼠HIRI模型构建成功。在此基础上，Uro-A低剂量组与高剂量组均能降低血清中ALT、AST与LDH水平，且高剂量组效果更为明显，表明对大鼠提前给予Uro-A可预防HIRI。

氧化应激失衡是引起HIRI的主要原因，因为缺氧会使线粒体产生大量氧自由基同时发生脂质过氧化过程[13]，进而激活下游通路，促进炎性细胞生成、炎症因子的释放等，最终导致细胞死亡和组织坏死。SOD、MDA与CAT是检测氧化应激的常用指标[14]。本研究发现，预防给药Uro-A能提高肝脏再灌注后SOD含量(P<0.01)，避免肝脏受到进一步损伤，同时Uro-A可清除再灌注后生成的MDA，高剂量组更为明显(P<0.01)。进一步检测发现，预防给药后肝组织CAT含量减少(P<0.01)，说明Uro-A能够清除肝脏组织中异常生成的过氧化氢，导致CAT合成减少。另外有研究[15]发现，肝脏中的巨噬细胞会在缺血再灌注后产生大量的炎症因子与趋化因子，如IL-1β、IL-6和TNFα等，造成组织出现炎症反应，损伤肝细胞。本研究对炎症因子检测发现，高剂量Uro-A预防给药能减少肝脏缺血再灌注后IL-1β、IL-6和TNFα的含量(P值均<0.01)，减轻炎症因子对肝脏造成的损伤。

病理学观察能直观地反映器官组织状态，对评价药物的治疗效果十分关键。本实验观察发现Uro-A组大鼠肝脏组织的“气球样”细胞明显减少，炎性细胞浸润程度下降，细胞排列结构也恢复整齐，高剂量组变化尤为明显。由此表明Uro-A可以预防缺血再灌注带来的肝损伤。

肝脏缺血再灌注后会激活某些凋亡通路，诱导正常或受损的肝细胞死亡[16]。本研究发现Uro-A组中肝细胞的凋亡数量明显减少，凋亡率也明显降低(P<0.01)，说明Uro-A可以防止肝细胞在缺血再灌注中发生凋亡，但其中机制尚未明确。有研究[17]报道，内质网应激会调控凋亡通路，其中GRP78和CHOP能在应激状态下诱导Caspase-12的释放，加快细胞凋亡。本实验检测肝组织中内质网与凋亡相关蛋白后发现，Uro-A高剂量组中GRP78与CHOP蛋白表达量明显下降，其下游的Caspase-12蛋白表达量也随之降低(P值均<0.05)，表明Uro-A能通过抑制GRP78/CHOP内质网通路，导致Caspase-12生成减少，产生抗凋亡的效果。故Uro-A能预防肝脏缺血再灌注后的细胞凋亡，减少肝细胞的凋亡数量，其作用机制是抑制GRP78/CHOP内质网应激通路。

综上所述，HIRI是一种由多种因素造成的损伤，是缺血与再灌注共同影响的动态过程，涉及代谢紊乱、氧化应激、炎症反应、内质网应激及细胞凋亡等多个途径。本研究采用中药有效提取成分Uro-A作为研究药物，对大鼠进行预防给药，发现该药物能在缺血再灌注中起到保护肝脏的作用，主要表现为提高肝功能、平衡氧化应激、减少炎症因子的释放、降低肝细胞凋亡等，其作用途径可能与内质网应激通路相关，为今后研究开发相关药物提供了一种可行性。目前关于Uro-A的肝毒性反应尚无报道，但由于Uro-A在体内会被吸收转移到肝脏，因此预防给药的剂量需要严格控制，既要有药效又不能造成肝脏损伤，这是今后需要进一步研究的问题。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：米凯、黄锐负责课题设计，资料分析，撰写论文，修改论文并最后定稿。