克罗恩病组织中网状蛋白-1C的表达水平及意义

张 磊 张李群 王冬梅 周 怡

克罗恩病(CD)是一种缓解和复发反复交替的炎性肠病，临床主要表现为腹痛、腹泻、腹部包块等[1-2]。CD患者的临床过程差异较大，部分CD患者缓解后不易复发，有些患者甚至终生无疾病活动，但仍有部分CD患者反复发病，严重影响了生活质量，也增加了CD相关并发症的发生风险，如复杂肛瘘、肠瘘、肠穿孔及肠梗阻等[3]。目前针对CD的治疗药物主要有5-氨基水杨酸、抗肿瘤坏死因子-α单抗、糖皮质激素及免疫抑制剂等，上述药物均对黏膜愈合有一定的疗效，但长期应用会诱发不良反应，还会降低疗效[4]。因此，对于上述药物的应用需权衡效益-风险比。探究CD发病的病理生理机制，以及可预测病情和预后的生物学标志物的意义重大。目前已有许多研究证实细胞自噬与CD的发病及疾病进展有关[5-7]。有研究表明网状蛋白-1C(RTN-1C)过表达可激活细胞自噬，而抑制其表达则可显著降低细胞的自噬程度[8]。本研究采用蛋白质免疫印迹法检测CD组织中RTN-1C的表达水平，并探究其与病情严重程度及预后的关系，以期为CD病情及预后的评价提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2016年3月至2018年1月在浦东新区浦南医院确诊并接受治疗的113例CD患者作为研究对象。CD的诊断符合《中国炎症性肠病组织病理诊断共识意见》[9]。纳入标准：(1)年龄>18岁；(2)首次诊断为CD并接受治疗；(3)接受结肠镜检查；(4)签署知情同意书。排除标准：(1)治疗前曾服用抗生素；(2)合并其他自身免疫性疾病；(3)近1个月内有急性感染性肠炎史；(4)合并恶性肿瘤；(5)肝、肾功能异常；(6)不配合检查及随访。113例CD患者中，男性76例，女性37例，年龄27～58岁，平均年龄(41.38±6.27)岁；内镜下疾病活动度轻度29例，中度47例，重度37例。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 CD内镜下疾病活动度判定

采用CD简化内镜评分(SES-CD)评价内镜下疾病活动度[10]。SES-CD将肠道分为末端回肠、右半结肠、横结肠、左半结肠和直肠5部分，每个部分从4个维度进行评价，即溃疡大小、溃疡面积、受累肠道面积及肠腔狭窄情况，任一维度的评分均为0～3分，总分越高表示CD病情越严重。缓解：0～3分；内镜下疾病活动度轻度：4～10分；内镜下疾病活动度中度：11～19分；内镜下疾病活动度重度：≥20分。

1.3 CD组织中RTN-1C水平检测

采用蛋白质免疫印迹法检测CD组织中的RTN-1C表达水平[11]，具体步骤：(1)取CD组织，滴加RIPA裂解液，提取总蛋白；(2)用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量；(3)电泳120 V 100 min，转膜200 mA 90 min；(4)PBS洗膜，脱脂牛奶室温封闭1 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜；(5)PBST漂洗，加入二抗，室温孵育1 h；(6)曝光显影，用ImageJ软件分析结果。

1.4 预后随访及评价

通过复诊及电话随访等方式了解CD患者治疗后2年的预后情况。于CD患者出院后1个月开始随访，每月随访1次，了解CD相关并发症发生情况、是否接受手术治疗及CD相关死亡等。随访的终点为随访时间满2年或发生终点事件(如复杂肛瘘、肠瘘等)。本研究将CD相关并发症(复杂肛瘘、肠瘘、肠穿孔、肠梗阻、消化道大出血、腹腔脓肿等)、接受手术治疗及CD相关死亡定义为预后不良[12]。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 RTN-1C与CD患者内镜下疾病活动度的关系

内镜下疾病活动度轻度、中度和重度CD患者的RTN-1C水平分别为2.19±0.34、1.84±0.36和1.42±0.40，差异有统计学意义(F=35.587，P<0.001)。内镜下疾病活动度重度CD患者的RTN-1C水平低于轻度和中度CD患者，差异均有统计学意义(q=11.810，P<0.05；q=7.328，P<0.05)；内镜下疾病活动度中度CD患者的RTN-1C水平低于轻度CD患者，差异有统计学意义(q=5.583，P<0.05)，见图1。CD患者的SES-CD为(16.03±7.54)分。CD患者的RTN-1C水平与SES-CD呈负相关关系(r=-0.754，P<0.001)，见图2。

图1 不同内镜下疾病活动度CD患者的RTN-1C水平比较

图2 CD患者RTN-1C水平与SES-CD的相关性分析

2.2 RTN-1C与CD患者预后的关系

113例CD患者中有34例(30.09%)预后不良，其中3例(2.65%)并发复杂肛瘘，4例(3.54%)并发肠瘘，5例(4.42%)并发肠梗阻，3例(2.65%)并发腹腔脓肿，2例(1.77%)并发消化道大出血，16例(14.16%)接受肠切除手术治疗，1例(0.88%)CD相关死亡。预后不良患者的RTN-1C水平为1.44±0.41，低于预后良好患者(1.95±0.41)，差异有统计学意义(t=26.036，P<0.001)。

2.3 RTN-1C评价CD患者预后的价值

RTN-1C诊断CD患者预后的ROC曲线下面积(AUC)为0.809(95%CI：0.724～0.877)，最大约登指数为0.494，其所对应的最佳截断点、敏感度和特异度分别为1.91、91.18%和58.23%，见图3。

图3 RTN-1C诊断CD患者预后的ROC曲线

2.4 影响CD患者预后的相关因素分析

预后不良组和预后良好组的年龄、性别、病变部位、C反应蛋白、红细胞沉降率及上消化道受累相比较，差异均无统计学意义(P<0.05)；两组的疾病行为、肛周病变及RTN-1C水平相比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。将CD预后作为因变量，将可能影响预后的相关因素疾病行为、肛周病变、RTN-1C及上消化道受累作为自变量纳入Logistic多因素分析(纳入标准P<0.1)，结果显示疾病行为、肛周病变是CD患者预后的独立危险因素(P<0.05)，RTN-1C是CD患者预后的独立保护因素(P<0.05)，见表2。

表1 两组临床资料比较/例(%)

表2 影响CD患者预后的多因素Logistic回归分析

3 讨论

细胞自噬与CD关系密切。细胞自噬包括双层膜的杯状分隔膜形成、自噬体形成、自噬体运输其包裹物与溶酶体融合、自噬体被溶酶体降解4个过程[13]。细胞自噬可降解机体内变性的蛋白质、内源性或外源性病原体，还可在细胞处于饥饿等应激状态时消化受损或衰老的蛋白质，以维持细胞的正常代谢。此外，自噬过程还可杀灭病原体，并可激活固有免疫细胞，同时自噬底物充当抗原的角色刺激适应性免疫细胞，激活适应性免疫应答[14-15]。由此可见，细胞自噬过程在维持细胞内环境稳态和免疫功能方面发挥着重要作用。

RTN-1C是RTN家族的成员，主要存在于内质网膜上，可调节内质网结构及功能[16-17]。LC3蛋白是细胞自噬小体形成的标志物[18]，RTN-1C可上调自噬体及LC3蛋白水平[19]。此外，RTN-1C还可通过诱导内质网应激通路调节线粒体形态及其活性，参与线粒体相关内质网膜形成，进而影响细胞质内Ca2+稳态及线粒体与内质网之间的脂质交换，促进细胞自噬[8]。

本研究采用蛋白质免疫印迹法检测CD组织中RTN-1C的表达水平，通过比较不同内镜下疾病活动度CD患者的RTN-1C水平，发现内镜下疾病活动度重度CD患者的RTN-1C水平低于轻度和中度CD患者，内镜下疾病活动度中度CD患者的RTN-1C水平低于轻度CD患者，该结果提示CD组织中的RTN-1C水平可能与CD病情严重程度有关，可能参与了CD的发生、发展过程。

SES-CD量表是评价CD患者病情的权威指标，能够准确反映CD病情的严重程度[20]。本研究发现CD组织中RTN-1C水平与SES-CD评分呈负相关关系，该结果进一步证实了RTN-1C可能参与了CD的发病及疾病进展过程。

本研究随访结果显示，113例CD患者中有34例(30.09%)预后不良，与杨荣萍等[12]的调查结果相似。比较预后不良患者和预后良好患者的RTN-1C水平，发现前者的RTN-1C水平低于后者，该结果提示RTN-1C与CD患者的预后密切相关，可能有助于CD患者预后评估。本研究构建了RTN-1C评价CD患者预后的ROC曲线，结果显示其评价CD患者预后的AUC、敏感度和特异度分别为0.809、91.18%和58.23%，表明RTN-1C对CD患者预后有较高的诊断价值，但特异度较低。为进一步明确RTN-1C与CD患者预后的关系，本研究进行了单因素方差分析及多因素Logistic回归分析，结果显示疾病行为、肛周病变是CD患者预后的独立危险因素，这与黄超群等[21]的研究结果一致。此外，本研究还显示RTN-1C是CD患者预后的独立保护因素。笔者推测RTN-1C水平可反映CD患者肠黏膜组织的自噬程度，通过检测RTN-1C水平可了解自噬程度，进而预测CD患者的病情严重程度及预后。

综上所述，CD组织中RTN-1C表达水平低提示患者病情严重。预后良好的CD患者的RTN-1C表达水平高。检测CD组织中RTN-1C表达水平有助于评价CD患者的病情严重程度及预后。本研究尚未对RTN-1C参与CD发病及疾病进展的病理生理机制进行研究，今后将开展基础实验进行探索，以弥补本研究的不足。