富亮氨酸重复结构在结直肠癌发病机制中作用的研究进展

张家媛 李楚荞 黄淑敏 郭莲怡 曹海龙

结直肠癌(CRC)是一种常见的恶性肿瘤，全球发病率在恶性肿瘤中居第3位，病死率居第2位，并且呈上升趋势[1]。有研究表示，中国CRC患者和病死人数预计于2025年达到642.3万和221.1万[2]。目前已知有60多种人类疾病与编码富亮氨酸重复结构(LRR)蛋白质的基因突变有关[3]。在CRC发生、发展过程中，LRR参与了肠道慢性炎性反应的发生、肠道菌群的调节以及直接介导肿瘤的发生和转移等过程。因此，了解LRR在CRC中的作用机制可以为CRC的防治提供思路。LRR是一类高度保守的氨基酸序列，可介导蛋白之间的相互作用，一个LRR蛋白包含多个LRR亚家族。目前已知的LRR分为8个亚家族：核糖核酸酶抑制剂状亚家族、SDS22状亚家族、含半胱氨酸的LRR亚家族、细菌LRR亚家族、植物特异性LRR、梅毒螺旋体LRR、典型的LRR蛋白及嵌套的IRR。它们广泛存在于病毒和真核生物中，参与细胞外、细胞质、细胞膜内外及跨膜蛋白等多种蛋白的组成，在信号转导、固有免疫反应、细胞凋亡及自噬等多种生理过程中起着重要的作用，并参与多种疾病的发生、发展过程。本文就LRR参与CRC发病机制的相关研究进展作一综述。

1 LRR与CRC的发病机制

目前已知与CRC发生相关的LRR包括：参与模式识别受体构成的Toll样受体(TLR)、NOD样受体(NLR)、LRRC19及LRR的G蛋白耦联受体(Lgr5)等。其中TLR主要包括TLR2、TLR3、TLR4、TLR7及TLR9，NLR主要包括NLRC1、NLRC2、NLRC3、NLRC4、NLRP3、NLRP6及NLRP12，LRRC19是新发现的存在于肠上皮细胞的新型受体，LRR的免疫球蛋白样蛋白(ISLR)可直接介导CRC，Lgr5受体是人类肠道肿瘤干细胞(CSC)特异性标志物。这些LRR能参与CRC发病机制中的多个环节。

1.1 TLR与CRC

微生物环境在肿瘤发生、发展和转移中起着重要的作用，肠道微生物可与人体内信号转导模式识别受体结合，通过免疫应答的方式激活调节炎性反应的途径和多种细胞的增殖[4]。慢性炎性反应可产生大量的炎性介质及细胞因子，它们能激活核因子-κB(NF-κB)信号转导途径，导致CRC发生。此外，不同种类微生物的代谢产物也可通过不同方式促进CRC发生。模式识别受体中的TLR家族是Ⅰ型跨膜糖蛋白，在肠上皮细胞中以多种表达形式存在。TLR能识别外源性病原相关分子模型(PAMP)和内源性危险相关分子模式(DAMP)。TLR信号途径主要有两种：一种由髓样分化因子88(MyD88)衔接蛋白介导，另一种则是不依赖MyD88的途径，如TLR3途径。MyD88依赖信号转导调控包括NF-κB信号转导途径在内的多个肠道肿瘤发生关键通路。TLR和白细胞介素-1受体(TIR)分别识别微生物或内源性配体和炎性介质，通过MyD88途径参与癌基因诱导的细胞内炎性反应和肿瘤相关炎性反应。异常的TLR活化可导致NF-κB信号转导激活和炎性细胞因子过表达。这些证据都表明TLR家族与CRC密切相关。

根据种类不同，TLR在CRC发生、发展中的作用并不一致，其中有关TLR4的研究较为深入。Yu等[5]发现TLR4/MyD88途径与具核梭杆菌通过选择性丧失微RNA-18a(miR-18a)和miR-4802激活CRC细胞自噬的过程有关。Yang等[6]发现具核梭杆菌可激活TLR4信号，转导至MyD88，导致NF-κB活化并使miR-21的表达升高，从而促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。Koliaraki等[7]发现肠道间充质细胞和肿瘤相关的成纤维细胞可以被TLR4/MyD88介导的信号激活并促进CRC发生。此外，Eiro等[8]发现肿瘤细胞的TLR4表达和肿瘤相关的成纤维细胞的基质金属肽酶11表达可能有助于评估Ⅱ期CRC患者的复发风险。

除TLR4外的TLR家族成员TLR2、TLR3、TLR7及TLR9也参与了CRC的发生、发展过程。Kuugbee等[9]发现增加CRC大鼠模型的TLR2信号转导可介导益生菌混合物的抗肿瘤作用。但有研究提出TLR2缺陷会促进肿瘤的发展[10]。相关研究发现，TLR3/TLR衔接分子1(TICAM1)途径通过抑制C-myc基因的表达抑制息肉生长，并可使Apcmin/+小鼠的生存期延长[11]。另有研究发现TLR7的多态性对转移性CRC中基于西妥昔单抗的化学治疗的疗效具有预测价值[12]。而来自同一CRC患者的增生性息肉和绒毛状息肉中的TLR9表达均降低，提示TLR9表达可能对肠黏膜的恶性转化具有保护作用[13]。由此可见，TLR4与CRC的关系十分密切，而TLR2、TLR3、TLR7及TLR9在CRC发病机制中的具体作用尚需进一步探索。

1.2 NLR与CRC

人类NLR家族为细胞质型模式识别受体，根据N端结构域不同分为4个亚家族，其功能活性失调可导致炎性疾病和自身免疫反应发生，其中NLRC亚家族和NLRP亚家族中的多个受体与CRC的发生有关[14]。有研究显示，在CRC的发生过程中，NLRC亚家族的NLRC1和NLRC2的表达升高，而NLRC3和NLRC4的表达降低。相关研究表明，NLRC1在T细胞中可通过增强干扰素-γ(IFN-γ)的应答减少结肠炎相关肿瘤的发生[15]。NLRC2是炎症性肠病(IBD)的易感基因，并与CRC的发生相关。NLRC1和NLRC2都可通过干扰素调节因子4(IRF4)阻断NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)转导通路。Udden等[16]发现 NLRC2可负调节TLR/NF-κB和MAPK转导通路，进而抑制炎性反应和肿瘤发生。另有研究发现，NLRC3可抑制磷脂酰肌醇3-激酶/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/mTOR)信号通路，从而减少细胞增殖、调节细胞凋亡[17]。而NLRC4炎性小体可介导天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)调节上皮细胞对损伤的反应，以预防结肠炎性反应诱导的肿瘤发生[18]。

在NLRP亚家族中，激活的NLRP3炎性小体可使caspase-1上调白细胞介素-1β(IL-1β)的表达从而促进慢性炎性反应和CRC的发生[19]。此外，Deng等[20]发现NLRP3炎性小体可促进CRC肝转移。NLRP6主要由结肠干细胞生态位内的肌成纤维细胞产生，其可调节组织修复，抑制炎性反应和肿瘤发生。

1.3 LRRC19受体与CRC

广泛存在于肠上皮细胞中的LRRC19是一种功能性跨膜蛋白受体，它不含细胞质Toll/TIR结构域，但能激活NF-κB并诱导促炎细胞因子的产生。在正常生理条件下，TLR和NLR的表达水平较低，不能对刺激产生反应。LRRC19在肠上皮细胞中高度表达，并直接介导肠上皮细胞中的肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)/NF-κB和TRAF6/NF-κB信号通路。研究发现，LRRC19敲除的小鼠肠道缺乏免疫炎性反应，结肠切片未见明显的炎性反应和浸润，且细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-17和IL-12的表达均低于野生型小鼠。LRRC19敲除后小鼠体内几乎测不到结肠炎相关NF-κB、p65和STAT3，CRC相关标志物，β-连环蛋白(β-catenin)和环氧合酶-2(COX-2)也较野生型少。因此，LRRC19与结肠炎及其相关肿瘤的发生有关[21]。

1.4 ISLR与CRC

ISLR是一种分泌蛋白，可被肠道炎性反应和肿瘤的基质细胞中致癌转录因子ETS1诱导分泌表达。ISLR可抑制肠道再生和肿瘤发生过程中的Hippo信号转导并激活上皮细胞中的YAP因子，敲除小鼠基质细胞中的ISLR可显著影响肠道再生并抑制CRC的发生。此外，IBD患者的肠黏膜和结肠腺癌患者的ISLR表达显著升高，表明其参与了肠道肿瘤的发生过程[22]。

1.5 Lgr5干细胞与CRC

Lgr5是一种7次跨膜G蛋白偶联受体，标记包括结肠等多种组织的正常干细胞，可增强经典Wnt信号通路，且其本身是下游Wnt靶基因。Lgr5+是肠道CSC亚群的标志物，其过度表达可增强Wnt/β-catenin信号转导，从而促进CRC的发生。He等[23]发现，与非肿瘤组织相比，CRC组织中Lgr5+表达明显升高，其mRNA表达与CRC组织中的β-catenin表达呈正相关；Lgr5+的表达与CRC患者的TNM分期、淋巴结转移、血管侵犯及肿瘤血管生成等临床病理学特征显著相关。近年来研究发现，高脂饮食可通过升高肠道胆汁酸水平拮抗肠道胆汁酸受体FXR，驱动Lgr5+表达，促进CSC的恶性转化和腺瘤、腺癌的进展[24]。此外，已有研究证明Lgr5+表达与临床预后不良相关，Lgr5+过表达与CRC患者的生存率、肿瘤的浸润深度及远处转移有关，可作为CRC治疗的预后预测指标[25]。Lgr5+对Apc基因突变CRC细胞的调节还与其他信号转导有关。Lgr5+通过与GTP激酶活化蛋白1(IQGAP1)及其效应因子Rac1途径相互作用，从而控制隐窝干细胞中肌动蛋白细胞骨架结构和潜在的细胞间黏附作用[26]。

在原发肿瘤样本中对Lgr5表达和功能的研究表明，Lgr5在CRC发展中有潜在的抑癌功能。有研究发现CRC进展期的Lgr5表达下调，Lgr5在CRC细胞系和原发肿瘤中均被甲基化，并在脱甲基剂的作用下重新表达后，能降低细胞系和结肠腺瘤的克隆形成能力，抑制了异种移植后的肿瘤生长[27]。此外，Lgr5对Wnt信号存在着负调控，对其基因表达具有抑制作用，Lgr5-的动物体内Wnt靶基因(Axin2、Ascl2和CD44)显著上调。Lgr5分子可通过限制细胞增殖在CRC中发挥抑癌作用，过表达的Lgr5能导致细胞黏附增加，克隆形成性降低和致瘤。Wu等[28]的研究进一步支持了其对肿瘤的限制性作用，Lgr5过表达可抑制HT29细胞的增殖。该结果似乎与之前提到的Lgr5过表达促进肿瘤增殖相矛盾，这很可能是由于所使用的实验模型和系统的广度以及Lgr5功能的复杂性而引起的。CRC肿瘤的复杂性是由包括肿瘤异质性、肿瘤分期、起源细胞、干细胞层次和微环境等因素驱动的，这意味着Lgr5功能可能会发生很大变化，具体取决于评估的背景。尽管Lgr5在CRC中的作用存在争议，但可以肯定的是，在肿瘤恶性转化过程中，Lgr5的表达在介导肿瘤存活和(或)增殖中起着关键作用，其在CRC发生、发展的特定时刻发挥着重要作用。

2 LRR相关CRC防治的新策略

LRR参与CRC发生、发展的多个环节，为CRC的防治提供了新的方向。TLR激动剂在激活先天性和适应性免疫应答中起着重要作用，越来越多证据表明TLR可能在各种细胞中表达。有研究发现，通过自然杀伤T细胞的配体α-半乳糖神经酰胺与TLR9激动剂CpG-1826结合，可抑制小鼠的肿瘤生长，并诱导长期抗肿瘤适应性记忆的形式[29]。由于MyD88是TLR信号通路中重要的衔接分子，有学者基于MyD88分子结构合成了新化合物TJ-M2010-5，其可与MyD88结合干扰TLR信号转导，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，并可抑制小鼠结肠组织中细胞因子和趋化因子产生，并抑制免疫细胞浸润[30]。Xiao等[31]发现丁酸盐可通过调节CRC细胞中TLR4的表达及其信号转导途径来改善肠道免疫微环境。

F-box/LRR-重复蛋白2(FBXL2)是肿瘤抑制因子，已被证实可通过降解肺癌和急性白血病患者的细胞周期蛋白来调节细胞增殖和凋亡。最近有研究发现，FBXL2作为miR-346-5p(一种在CRC中过度表达的miRNA)的直接靶标，可下调参与CRC发生的β-catenin通路，从而抑制肿瘤生长[32]。

Lgr5+在CRC的发生和进展中起着重要作用。Junttila等[33]发现抗体-药物耦联物可通过与Lgr5+抗体结合，减小肿瘤体积及抑制肿瘤增殖，从而靶向治疗肿瘤。这可能是Lgr5靶向最有效之处(单独或与当前化学治疗药物联合应用)，如在预防/恢复转移转化方面。这将规避与长期Lgr5+细胞消融相关的不良反应，并确定人CRC发生的阶段，在该阶段Lgr5疗法可诱导强效的临床缓解。这些研究提示，LRR相关的靶向抗肿瘤治疗在今后的CRC防治中可能发挥重要作用。

3 小结与展望

LRR参与了CRC发生、发展的多个过程，包括激活肠道炎性通路、调节肠道微环境、促进转移、预测预后和抑制肿瘤发展等。然而，是否还有其他的LRR在CRC发病机制中起着重要作用；已知LRR的作用机制，相关靶向药物是否可行及其安全性等问题尚待解决。对LRR与CRC发病机制关系的研究将为CRC的预防及早期诊断、靶向抗肿瘤治疗和降低转移及复发率等方面提供理论依据及新的策略。