蛇床子素抑制PI3K/AKT/mTOR的活化诱导视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡和抑制裸鼠成瘤的研究

杨 娟，唐燕君，李文东，李红军，康 帅

视网膜母细胞瘤恶性程度较高，易发生转移，该病好发于婴幼儿，对其健康构成极大威胁[1-2]，故早期有效治疗很重要。蛇床子素是植物蛇床的果实。《本草纲目》和《别录》中相关记载显示，蛇床子味辛、苦，性温，入肾、脾经，可温肾助阳、祛风、燥湿、杀虫，治疗男子阳痿、阴囊湿痒、女子带下阴痒、子宫寒冷不孕、风湿痹痛、疥癣湿疮等症[1]。现代药理研究认为，蛇床子具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种功效[1]；其抗肿瘤作用在近年来受到越来越多的关注。动物实验研究显示，蛇床子素可抑制鼠肝癌、乳腺癌转移等[2-3]；但目前关于其抗视网膜母细胞瘤的研究尚不多见，本研究采用Y79细胞建立视网膜母细胞瘤裸鼠玻璃体腔移植瘤模型，从分子层面分析了蛇床子素通过抑制PI3K/AKT/mTOR的活化，诱导视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡和抑制裸鼠成瘤的作用。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物和药物：选取出生24 h内BALB/C-nu/nu雄性裸鼠60只，体重(1.51±0.16)g，购自凯学生物科技(上海)有限公司，饲养于SPF级动物房，室温24℃，湿度60%。蛇床子素(西安应化生物技术有限公司，20 mg/支)用生理盐水将其配成浓度为8、16、32 μmol/L，4℃冰箱保存备用。

1.1.2瘤株：RB-Y79细胞株购自研域生育技术(上海)有限公司，培养于含10%胎牛血清(上海江林生物科技有限公司)的RPMI 1604培养基(上海金畔生物科技有限公司)中，置于37℃、湿度95%、含5%CO2的培养箱中静置培养并进行传代。

1.1.3实验试剂：半胱天冬酶-3(Caspase-3)， Caspase-9活性检测试剂盒、反转录PCR(RT-PCR)试剂盒、磷脂酰丝氨酸结合蛋白-异硫氢酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒均购自上海沪震生物科技有限公司；抗PI3K,蛋白激酶B(AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、内参GAPDH抗体及其对应二抗均购自上海谷研实业有限公司，BCA蛋白定量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；聚丁二酸丁二醇酯(PBS)苯酚购自北京康普汇维科技有限公司；Trizol总RNA提取试剂购自合肥博美生物科技有限公司。

1.1.4实验仪器：WS-300恒温培养箱(上海旦鼎国际贸易有限公司)、YKDZ-55显微镜(上海永科光学仪器有限公司)、DXFLEX流式细胞检测仪(美国贝克曼库尔特公司)、DYCP-31DN琼脂糖水平电泳仪(艾科仪器有限公司)、DP/ZB 紫外线投射仪(北京亚欧德鹏科技有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞分组与给药：取2～3次传代后对数生长期细胞，将RB-Y79细胞重悬溶于RPMI 1604培养基中，将重悬后的细胞接种于96孔板中，4×103个/孔,于37℃、湿度95%、5%CO2的环境中培养24 h。将提前稀释至8、16、32 μmol/L的蛇床子素分别加入96孔板中，每个质量浓度设置5个复孔，将96孔板置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h。

1.2.2不同浓度的蛇床子素对Y79细胞凋亡的影响： 通过流式细胞仪检测，取2～3次传代后对数生长期细胞，将RB-Y79细胞重悬溶于RPMI 1604培养基中，将重悬后的细胞接种于96孔板中，4×103个/孔，于37℃、湿度95%、5%CO2的环境中培养48 h后，胰蛋白酶消化重悬，转移至离心管，调整每管细胞数约为1×105个，预冷PBS洗涤2次，按照凋亡试剂盒说明，向细胞中加入Annexin V 10 μl，避光孵育10 min,预冷PBS洗涤2次，向每管中加入PI溶液4 μl，立即用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.3Y79细胞中Caspase-3、Caspase-9的mRNA相对表达量：采用RT-PCR检测，提取各组Y79中的总RNA，提取后用紫外分光光度计检验，OD值(A260/A280)=1.8～2.1，并用凝胶电泳检测RNA的完整性；符合标准后进行反转录cDNA合成，反转录体系(10 μl)：2×miRNA反应混合液5 μl，0.1% BSA 1 μl，miRNA PrimeScript ®RT酶混合物1 μl，总RNA 0.5 μl，去RNA酶ddH2O 2.5 μl，反应条件设置：37℃ 60 min，85℃ 5 s，4℃ 30 min；cDNA获取后，进行qRT-PCR检测，PCR体系10 μl：SYBR®Prmix Ex Tap II(2×)5 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，ROX Reference Dye II(50×)0.2 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 3 μl，详细操作见试剂盒说明书，PCR反应参数设置：50℃激活聚合酶5 min，95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火和延伸34 s，反应进行40个循环。溶解曲线绘制：95℃ 15 s，60℃ 60 s，85℃ 15 s，60℃ 15 s，内参基因采用β-actin。每个样孔设置3个复孔，取平均Ct值进行分析，以2-ΔΔCt作为相对表达量。

1.2.4Y79细胞中凋亡蛋白表达水平及PI3K/AKT/mTOR磷酸化水平：采用WB检测，不同浓度蛇床子素作用Y79细胞24 h后，收集细胞，常规方法提取蛋白质，经凝胶电泳分离蛋白组分后，将蛋白转印于聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h；加入不同浓度的一抗(PI3K 1∶1000，AKT 1∶500，mTOR 1∶500)于4℃低速摇动孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)于37℃低速摇动孵育45 min，电化学发光发显色后胶片曝光并分析结果。

1.2.5实验动物分组及用药：选取40只BALB/C-nu/nu雄性裸鼠，随机分为对照组和蛇床子素组25、50、100 mg/kg组，每组10只。制备Y79细胞悬液(5×106个)于PBS缓冲溶液中，将裸鼠腋下皮肤消毒后，用1 ml注射器在腋下注射Y79细胞悬液，3 d后观察到肿块出现时，分别给予各组小鼠蛇床子素0、25、50、100 mg/kg灌胃，连续4 d，继续饲养30 d后处死裸鼠，完整剥离肿瘤组织，精密电子天平称肿瘤重量，并测量其体积。

2 结果

2.1不同浓度蛇床子素对Y79细胞凋亡的影响 蛇床子素8、16、32 μmol/L组细胞凋亡率均显著高于对照组，且呈浓度依赖型(P<0.05)。见图1。

图1 不同浓度蛇床子素对Y79细胞凋亡的影响A.流式细胞仪检测蛇床子素对Y79细胞凋亡情况；B.4组Y79细胞凋亡率比较；与对照组比较，aP<0.05；与蛇床子素8 μmol/L组比较，cP<0.05；与蛇床子素16 μmol/L组比较，eP<0.05

2.2不同浓度蛇床子素对Y79细胞中Caspase-3、Caspase-9的mRNA及蛋白表达水平的影响 与对照组比较，蛇床子素8、16、32μmol/L组Y79细胞中Caspase-3、Caspase-9的mRNA和蛋白相对表达水平均显著升高，且呈浓度依赖性(P<0.05)。见图2。

图2 不同浓度蛇床子素对Y79细胞Caspase-3、Caspase-9 mRNA及蛋白表达水平影响A.4组Y79细胞Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达水平比较；B.4组Y79细胞Caspase-3、Caspase-9免疫印迹检测结果及蛋白表达水平比较；与对照组比较，aP<0.05；与蛇床子素8 μmol/L组比较，cP<0.05；与蛇床子素16 μmol/L组比较，eP<0.05

2.3不同浓度蛇床子素对PI3K/AKT/mTOR蛋白磷酸化水平的影响 与对照组比较，蛇床子素8、16、32 μmol/L组的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR /mTOR水平均显著降低，且呈浓度依赖性(P<0.05)。见图3。

图3 不同浓度蛇床子素对PI3K/AKT/mTOR蛋白磷酸化水平的影响A.4组PI3K/AKT/mTOR蛋白免疫印迹；B.4组PI3K/AKT/mTOR蛋白磷酸化水平比较；与对照组比较，aP<0.05；与蛇床子素8 μmol/L组比较，cP<0.05；与蛇床子素16 μmol/L组比较，eP<0.05

2.4不同剂量蛇床子素对Y79细胞小鼠成瘤的影响 与对照组比较，蛇床子素20、50、100 mg/kg组视网膜母细胞瘤体积更小，重量更轻，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图4。

图4 不同剂量蛇床子素对Y79细胞对小鼠成瘤的影响A.4组小鼠肿瘤重量比较；B.4组小鼠肿瘤体积比较；与对照组比较，aP<0.05；与蛇床子素20 mg/kg组比较，cP<0.05；与蛇床子素50 mg/kg组比较，eP<0.05

3 讨论

细胞凋亡是由基因介导的一系列变化，是存在于细胞中的自毁机制。正常情况下，通过细胞凋亡过程机体能清除衰老及异常细胞，并能维持多细胞功能，如该过程发生病理性干扰，肿瘤细胞则会因存在凋亡缺陷而不断增殖[4-6]。既往文献报道，蛇床子素能促进肿瘤细胞凋亡、迁移、转移等[7-8]。本研究检测了不同浓度蛇床子素对Y79细胞凋亡和对视网膜母细胞瘤组织PI3K、AKT、mTOR 基因和蛋白表达的影响，旨在分析其抗视网膜瘤的作用及机制。

Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是细胞毒性T淋巴细胞杀伤机制的重要组成部分，其主要底物多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶与DNA修复、基因完整性监护有关；能负调控使Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶的活性增高，裂解核小体间的DNA引起细胞凋亡[9]。Caspase-9是一种凋亡蛋白，参与细胞凋亡过程的重要环节[10]。当线粒体释放细胞色素C并通过其与Caspase-9前体结合形成凋亡复合物，激活Caspase-9介导的线粒体信号凋亡通路引起细胞凋亡[11]。既往研究显示，蛇床子素可通过增加Caspase-3、Caspase-9的活性来抑制宫颈癌Hela-3细胞生长和促进前列腺癌细胞凋亡[12-13]。本研究结果显示，蛇床子素8、16、32 μmol/L组凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9水平及细胞凋亡率均高于对照组。表明蛇床子素可通过增加凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的活性诱导Y79细胞凋亡。

肿瘤细胞的凋亡可以通过很多信号通路实现，其中由PI3K、AKT、mTOR组成的PI3K/AKT/mTOR信号通路是肿瘤形成中重要的信号通路，该通路主导细胞的生长、存活、增殖、凋亡、血管生成、自吞噬等过程，一旦紊乱会引起包括癌症、神经病变、自身免疫性疾病和造血系统疾病等[5-6]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，与v．src和v．ras等癌基因的产物相关，其本身具有丝氨酸/苏氨酸激酶和磷脂酰肌醇激酶的活性，当接受来自酪氨酸激酶和G蛋白耦联受体的信号后，PI3K的p85调节亚基即被募集到邻近质膜的部位，使Akt从细胞质转移到细胞膜上；并在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶2的辅助下，分别使Akt蛋白上的苏氨酸磷酸化位点和丝氨酸磷酸化位点磷酸化而使其激活，激活的Akt又可激活和磷酸化其底物mTO，PI3K和其下游的AKT、mTOR组成的信号通路如异常激活，则会刺激肿瘤细胞的增殖[11-13]。本研究结果显示，与对照组相比，蛇床子素组能显著抑制Y79细胞中PI3K、AKT、mTOR基因及其蛋白的表达水平，减少p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR /mTOR水平。说明蛇床子素能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，诱导Y79细胞凋亡。推测其机制可能是蛇床子素对Y79细胞具有直接细胞毒性作用；能通过促进PI3K下调而引发负调控效应或是蛇床子素能直接抑制AKT、mTOR的表达从而诱导细胞凋亡。蛇床子素可通过某种机制增加凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的活性诱导Y79细胞凋亡[14-15]。本研究结果显示，与对照组相比，蛇床子素20、50、100 mg/kg组小鼠的肿瘤体积更小，重量更轻，且呈剂量依赖性。说明蛇床子素对视网膜母细胞瘤具有抑制作用。这可能与蛇床子素对Y79细胞有直接毒性作用，并促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤侵袭和转移的综合作用相关[16]。

综上所述，蛇床子素可通过抑制PI3K/AKT/mTOR的活化，增加Caspase-3、Caspase-9的活性，诱导视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡和抑制裸鼠成瘤。