元麦β-葡聚糖衍生物的合成及其抑菌作用

2020-08-28宋居易陈惠魏亚凤刘建

江苏农业科学 2020年14期

宋居易陈惠魏亚凤刘建

摘要：以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为试验菌，比较元麦β-葡聚糖和其衍生物对这2种细菌的体外抑菌作用，为元麦β-葡聚糖在食品保鲜中的应用奠定理论基础。以元麦β-葡聚糖为原料，采用氨基磺酸为酯化剂，制备硫酸化元麦β-葡聚糖;氯乙酸为醚化剂，制备羧甲基元麦β-葡聚糖;通过测量抑菌圈直径、最低抑菌质量分数、细菌生长曲线来考察元麦β-葡聚糖和其衍生物的抑菌活性。结果表明，制备出的硫酸化元麦β-葡聚糖取代度为0.82，修饰后的β-葡聚糖羧甲基的取代度为0.70，且红外光谱表明，元麦β-葡聚糖分子中已经分别成功引入了这2种基团;对比3种样品的抑菌活性，羧甲基元麦β-葡聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性均较好，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为40 mg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为80 mg/mL。综上所述，羧甲基元麦β-葡聚糖可用作生物抑菌剂。

关键词：元麦β-葡聚糖;硫酸化;羧甲基化;抑菌

中图分类号：TS201 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）14-0234-05

β-葡聚糖是一类存在于谷类作物和某些微生物中的高分子多糖。微生物中尤以酵母菌等真菌细胞壁中β-葡聚糖含量较高;谷物中一般以大麦和燕麦含量较高，大麦含量最高，燕麦次之[1]，元麦（裸大麦）的β-葡聚糖含量高于皮大麦，是食物中可溶性纤维的最佳来源[2]。β-葡聚糖由于具有天然、安全、无毒、可降解等特点，可作为生物保鲜剂进行开发，但它本身难溶于水，无法很好地发挥抑菌效果，抗菌谱不够宽。因此，对β-葡聚糖进行改性研究，为β-葡聚糖在食品保鲜中的应用奠定理论基础，同时为食品深加工提供新思路，促进食品产业链的延伸，对我国食品安全具有重大的战略意义。

在ISI和CNKI数据库中，对2001—2011年与葡聚糖相关的国际文献和国内文献分别进行统计分析发现，目前国内外学者对葡聚糖的研究主要集中在提取、结构和活性方面，但关于修饰改性葡聚糖使其具有更强或者新的生物活性的研究尚未成熟，相关领域研究的文献数量均不多[3]。Zhang等研究发现，羧甲基化会使虎奶菇菌核β-葡聚糖分子质量Mw从1×104～42×104 g/mol增至2.08×104～53.2×104 g/mol，而且体内和体外试验均表明，经羧甲基化修饰改性的β-葡聚糖具有抗肿瘤活性，而未修饰改性的β-葡聚糖无抗肿瘤活性[4]。Williams等采用二甲基亚砜和脲组成的均相反应体系和浓硫酸对酿酒酵母β-葡聚糖进行硫酸酯化改性，研究发现，酵母葡聚糖硫酸酯具有良好的水溶性、巨噬细胞活性和骨髓刺激作用，并且具有抗肿瘤活性[5]。Chen等分别研究了磷酸酯化修饰改性茯苓β-葡聚糖和茯苓菌丝α-葡聚糖的链构象及抗肿瘤活性，这一改变使得茯苓β-葡聚糖磷酸酯和茯苓菌丝α-葡聚糖磷酸酯具有显著的抗肿瘤活性[6-7]。目前，葡聚糖的修饰改性及其抑菌功能的研究较多集中在酵母葡聚糖上。牛宏彦等利用得到的硫酸化葡聚糖进行体外和体内抑制大肠杆菌效果研究，小鼠活体试验结果表明，硫酸化葡聚糖能显著提高大肠杆菌致腹膜炎的小鼠的成活率[8]。王米等测定了硫酸化酵母葡聚糖对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、猪链球菌等的体外抗菌活性，结果表明，葡聚糖对这几种菌具有一定的抑制作用[9]。

而关于元麦β-葡聚糖修饰改性并研究其抑菌作用的报道很少看到。本研究以元麦β-葡聚糖为原料，对其进行硫酸化和羧甲基化，得到易溶于水的元麦β-葡聚糖衍生物，并研究其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用，筛选出活性较高的 β-葡聚糖衍生物，为元麦β-葡聚糖的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

元麦β-葡聚糖由江苏沿江地区农业科学研究所提供;试验使用的菌株分别是大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC25922、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538;营养琼脂和营养肉汤均购于广东环凯微生物科技有限公司;主要仪器设备有DNP-9162型电热恒温培养箱（上海精宏试验设备有限公司）、LDZX-50KBS高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、BS-lEA恒温振荡培养箱（常州国华电器有限公司）、SCL-1300型垂直流洁净工作台（北京赛伯乐实验仪器有限公司）、Avatar FTIR360 红外光谱仪（美国Nicolet公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 元麦β-葡聚糖硫酸化

1.2.1.1 硫酸化元麦β-葡聚糖的制备[10]

称取0.5 g元麦β-葡聚糖溶于30 mL甲酰胺中，磁力搅拌使其充分溶解，加入1 g氨基磺酸，在70 ℃水浴下反应4 h，冰水浴冷却，用NaOH調pH值至中性，加入3倍体积无水乙醇使多糖沉淀，于4 ℃静置，离心，沉淀用水复溶，透析2 d，冷冻干燥得硫酸化元麦β-葡聚糖。

1.2.1.2 元麦β-葡聚糖硫酸化取代度的测定[11] 根据下列公式计算样品取代度（degree of substitution，简称DS）：

DS=（1.62×S%）/（32-1.02×S%）

式中：DS表示硫酸根取代度;S%表示硫元素含量（m/m），由硫酸根含量折算而得。

1.2.2 元麦β-葡聚糖羧甲基化

1.2.2.1 羧甲基元麦β-葡聚糖的制备

根据文献[12-13]进行操作，略有改变。称取2 g元麦 β-葡聚糖，加入到装有20 mL异丙醇的三口烧瓶，放入65 ℃恒温水浴锅中加热并振荡1 h;加入质量浓度为40%的NaOH溶液并搅拌，于65 ℃条件下反应 2 h;碱化完成后，称取200 mL的氯乙酸，缓慢加入后，反应5 h;反应结束后，添加蒸馏水至溶解，用盐酸中和停止反应，后抽滤，滤液依次用70%乙醇、无水乙醇洗涤，二次抽滤;然后将沉淀物放置于65 ℃烘箱中干燥，即可得到羧甲基元麦β-葡聚糖试样。

1.2.2.2 元麦β-葡聚糖羧甲基化取代度的测定[13]

利用下式计算羧甲基元麦β-葡聚糖的取代度。

DS=0.161A/（1-0.058A）;

A=（V2-V1）m/W。

式中：DS表示取代度;A表示每克样品中羧甲基的毫摩尔数;V2表示pH值为4.3时滴定消耗的NaOH标准溶液体积;V1表示pH值为2.1时滴定消耗的NaOH标准溶液体积;m表示样品净重;W表示NaOH标准溶液的浓度。

1.2.3 改性元麦β-葡聚糖红外光谱测定

采用KBr压片，400～4 000 cm 区间扫描。

1.2.4 元麦β-葡聚糖衍生物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌试验[14-17]

1.2.4.1 菌种的活化与菌悬液的制备

试验前将所选菌种进行传代培养，用取菌环将菌种以划线法接种到营养琼脂培养基上，37 ℃培养箱中培养 24 h，并按上述操作将所需菌种培养到第3代以上。将菌种活化后，培养至菌种生长良好。用接种环蘸取少量菌落于灭菌生理盐水中，摇匀，稀释成1×106～1×107 CFU/mL的菌悬液。

1.2.4.2 牛津杯法测定抑菌作用

将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿约20 mL，凝固。吸取200 μL 菌液入平板表面，用涂布器将菌液涂布均匀。在培养基表面垂直摆放牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入200 μL不同稀释度的待测样品，37 ℃培养12 h，测定抑菌圈直径（含孔径），以抑菌圈直径的大小表示抑菌活性的大小。

1.2.4.3 最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，简称MIC）的测定

采用2倍稀释法将硫酸化元麦β-葡聚糖和羧甲基化元麦β-葡聚糖供试液稀释成浓度分别为160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL 等7个系列浓度稀释溶液，向平皿中分别移取不同浓度的稀释液各1.0 mL，再分别移取各菌悬液0.2 mL，然后倒入相应的温度在 60 ℃左右的固体培养基，充分混匀，待其冷却凝固后，倒置于恒温培养箱中，在适宜温度下培养、观察，以不长菌的最低浓度为最小抑制浓度。

1.2.4.4 羧甲基元麦β-葡聚糖作用下供试菌生长曲线的测定

以D600 nm为纵坐标，培养时间t为横坐标，绘制羧甲基元麦β-葡聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作用的生长曲线图。

1.2.5 统计分析数据以平均值±标准差表示。采用SPSS 17.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 硫酸化元麦β-葡聚糖的红外光谱

由图1、图2对比可以看出，在1 243、818 cm-1处有特征吸收峰，它们分别对应S[FY=，1]O伸缩振动吸收峰和C—O—S吸收峰，这2个特征吸收峰可以说明硫酸根已经连接在元麦β-葡聚糖上了。用电位滴定法测得的产品的取代度为0.82。

2.2 羧甲基元麦β-葡聚糖的红外光谱

由图1、图3对比可以看出，在1 609、1 480 cm-1 处有特征吸收峰，它们分别对应 —COO— 特征吸收峰和与—COO—相连的次甲基吸收峰，这2个特征吸收峰可以说明元麦β-葡聚糖已经发生了羧甲基化。用电位滴定法测得的产品的取代度为0.70。

2.3 不同元麦β-葡聚糖改性产物的抗菌活性

经过12 h的培養，元麦β-葡聚糖、硫酸化元麦β-葡聚糖以及羧甲基元麦β-葡聚糖对2种细菌显示出不同的抗菌活性，分别测量抑菌圈直径。由表1可看出，元麦β-葡聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均是低敏感度的（抑菌圈直径在0～10 mm），硫酸化和羧甲基的元麦β-葡聚糖对金黄色葡萄球菌是高敏感度的（抑菌圈直径在15～20 mm），两者对大肠杆菌是中敏感度的（抑菌圈直径在10～14 mm）。硫酸化和羧甲基化的元麦 β-葡聚糖对2种细菌的抑菌圈直径更大一些，这是由于水溶性的元麦β-葡聚糖扩散性更好，可以更加迅速地进入细胞内部，扰乱细胞的正常代谢，从而使抑菌效果更强。羧甲基元麦β-葡聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径均显著大于硫酸化元麦β-葡聚糖的（P<0.05）。综上所述，对2种细菌抑菌效果均较好的是羧甲基元麦β-葡聚糖。

2.4 最低抑菌质量分数（MIC）的测定

选取对这2种供试菌均有较强抑制作用的羧甲基元麦β-葡聚糖，测定其MIC。由表2可知，当羧甲基元麦β-葡聚糖的浓度大于80 mg/mL时，对这2种致病菌均表现出良好的抑菌效果。羧甲基元麦β-葡聚糖对金黄色葡萄球菌的抑制作用强于大肠杆菌，其对金黄色葡萄球菌的MIC为40 mg/mL，对大肠杆菌的MIC为80 mg/mL。

2.5 羧甲基元麦β-葡聚糖对2种细菌生长曲线的影响

由图4可知，添加1/4MIC、1/2MIC、MIC的羧甲基元麦β-葡聚糖，金黄色葡萄球菌的生长受到了抑制，1/4MIC的羧甲基元麦β-葡聚糖可以轻微抑制金黄色葡萄球菌的生长，1/2MIC的羧甲基元麦 β-葡聚糖抑制1/3左右的金黄色葡萄球菌生长量，MIC的羧甲基元麦β-葡聚糖可以完全限制金黄色葡萄球菌的生长，说明其抑菌作用具有一定的浓度梯度性。

由图5可知，浓度在1/4MIC时，羧甲基元麦 β-葡聚糖对大肠杆菌没有抑制作用，1/2 MIC的羧甲基元麦β-葡聚糖抑制了大肠杆菌生长的1/6左右，处于MIC的羧甲基元麦β-葡聚糖对大肠杆菌生长具有明显的抑制作用，令其立即停止生长。

3 结论

根据试验结果可知，对元麦β-葡聚糖进行改性，制备出取代度为0.82的硫酸化元麦β-葡聚糖和取代度为0.70的羧甲基元麦β-葡聚糖，且红外光谱表明，元麦β-葡聚糖分子中已经分别成功引入了这2种基团。

研究元麦β-葡聚糖2种衍生物的抑菌活性，结果表明，羧甲基元麦β-葡聚糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径均最大，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为40 mg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为80 mg/mL，对这2 种致病菌生长曲线的抑制作用也呈现一定浓度依赖性。

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收稿日期：2019-08-11

基金项目：南通市应用基础研究（编号：MS12017022-6）。