高效液相色谱法测定食品中脱氢乙酸含量方法的优化
2020-08-28金荣陈丽丽李鑫宇
金荣 陈丽丽 李鑫宇
摘 要：利用高效液相色谱法建立一种快速测定食品中脱氢乙酸含量的分析方法，解决GB5009.121色谱法测定脱氢乙酸保留时间漂移、色谱峰宽、色谱峰拖尾的问题。结果表明经过方法优化后，经安捷伦ZORBAX Eclipse XDB C18柱分离，流动相甲醇+乙酸铵（10+90），柱温40℃，波长230nm，流速1mL/min，进行定量分析呈良好的线性关系，相关系数r=0.9998，回收率（92.30-101.55）%，RSD（n=6） ：0.1%，检出限0.0013g/kg。
关键词：脱氢乙酸;pH值;色谱柱;高效液相色谱
脱氢乙酸别名二乙酰基乙酰酸，固态呈白色或淡黄色结晶粉末，无嗅，无味，是一种在酸、碱条件下均有高效防腐，防霉的低毒抑菌剂，其中主要是抗酵母菌和霉菌有较强的抑制作用，所以现食品加工中经常会出现在不同的食品中，在我国最大允许加入量是1.0g/kg。
目前脱氢乙酸的国标测定方法5009.121-2016中，第一法是气相色谱法，第二法是高效液相色谱法，气相色谱法测定时处理熟肉制品过程中加入乙酸乙酯振摇后静置分层，分层时间会很常，离心的效果也不佳。在室温放置效果会好些。液相色谱法测定时处理熟肉制品为了增长色谱柱的使用寿命，建议用固相萃取小柱。用液相色谱测定脱氢乙酸时常会遇到保留时间漂移，色谱峰拖尾特别严重。本实验通过方法优化，达到在稳定色谱条件下分析目标物的目的。
1、检验方法
1.1仪器与试剂
高效液相色谱：仪安捷伦1260 ，天平：梅特勒万分之一，离心机：Neofugt18R上海力申科学仪器有限公司，pH计：S470-k梅特勒 ，甲醇：色谱纯，德国默克;脱氢乙酸：99.9%上海安谱科学仪器有限公司;SPE小柱;乙酸铵优级纯，天津科密欧化学试剂有限公司;其它试剂均为优级纯，实验用水满足GB/T6682的一级水。
1.2标准曲的配制
1.2.1脱氢乙酸标准贮备液（1.0mg/mL）：准确称取脱氢乙酸标准品0.1000g（精确至0.0001g）于 100mL容量瓶中，用10mL氢氧化钠溶液溶解，用水定容。
1.2.2脱氢乙酸标准工作液：
分别吸取脱氢乙酸贮备液0.1mL、1.0mL、5.0mL、10mL、20mL于100mL 容量瓶中，用水定容。配制成浓度为1.00μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL 标准工作液。
1.3样品的处理
称取试样2克-5克（精确至0.001g）于50mL离心管中，加入10mL水、5mL硫酸锌溶液，用氢氧化钠溶液调pH至7.5，转入50mL容量瓶中，加水稀释到刻度，摇匀。置于离心管中，超声提取10分钟，转移到分液漏斗中，加入10mL正己烷，振摇1min，静置分层，弃去正己烷层，加入10mL正己烷重复进行一次，取下层水相置于离心管中，4000r/min离心10min。取 20 mL 上 清 液，用 10%的甲酸 调pH 至5，定容到25mL，取5mL过已活化的固相萃取柱，用5mL水淋洗，2mL70%的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液2mL混合均匀，过0.45μm有机滤膜，供高效液相色谱测定
1.4色谱条件
色谱柱：安捷伦ZORBAX Eclipse XDB C18 经0.2%磷酸的甲醇溶液，0.1ml/min冲洗12小时
流动相：甲醇+乙酸铵0.02mol/L（10+90）
检测器：紫外检测器波长230nm，柱温40℃，进样量10微升，总流速1.0mL/min，用保留时间定性、峰面积定量。
2、结果
2.1优化前后色谱图的比较
优化前：色谱柱未处理 波长293nm，柱温30℃
如图所示10μg/mL和50μg/mL标液的出峰时间分别为13.697min、11.562min，色谱峰出峰时间和结速时间跨距长达10分钟。
优化后：色谱柱冲洗12小时 波长230nm，柱温40℃
由图所示，出峰时间一致，重现性好，解决了出峰时间漂移、峰形宽、峰拖尾的问题。
2.2 标准曲线、回收率、精密度
使用以上方法配制的标准曲线进行测定，以浓度同峰面积为坐标绘制曲线，得到回归方程是Y=57.452x-24.303、 r=0.9998，线性良好，回收率（92.30-101.55）%.精密度RSD 0.1%。在这样的条件下，以3倍信噪比为检出限，以10倍信噪比为定量限，进行测定，检出限达到0.0013g/kg，定量限达到0.0032g/kg。用此方法测定的回收率、精密度、检出限与定量限均达到了国家标准要求。
3、结论
经过方法优化后，經安捷伦ZORBAX Eclipse XDB C18柱分离，流动相甲醇+乙酸铵（10+90），柱温40℃，波长230nm，采用外标法定量满足分析要求，该方法弥补了国家检验标准不足，可以提高我们实验室的检测的准确率 。
