高压氧治疗对局灶性脑梗死大鼠的神经保护作用

于秋红，李婕，刘亚玲，王丛，任梓齐，薛连璧

迄今为止，脑梗死的治疗思路主要有两方面：一是尽快恢复缺血区域的血流，如动静脉溶栓[1]和血运重建术[2]，二是神经保护治疗，但到目前为止，在动物实验中证实有效的神经保护药物仍未在临床试验中获得有力证据。综合动物研究及临床观察，大部分研究支持高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）治疗对于缺血性脑血管病是有益的[3]，其机制除了直接改善缺氧并减少缺氧导致的一系列病理损伤，还可能影响细胞的凋亡、缺氧诱导因子、肿瘤坏死因子等信号转导及基因表达，起到神经保护作用[4-5]。本课题组前期动物实验研究提示，单次9 h HBO治疗能促进脑新生血管的形成和侧支循环的建立[6]，影响细胞色素C及caspase-3，通过caspase依赖途径影响细胞凋亡[7-8]，但是观察时间点较少。本研究增加观察时间点，并观察HBO治疗对非caspase依赖途径细胞凋亡的影响，进一步探讨HBO治疗对局灶性脑梗死大鼠的神经保护机制。

1 研究对象与方法

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1.3 治疗方法 采用上海减压器厂生产的圆筒形透明有机玻璃实验舱。HBO组造模成功后3 h开始HBO治疗，升压20 min，治疗压力0.2 MPa，稳压9 h，为避免氧中毒，大鼠稳压后第1、3、5、7、9 h呼吸纯氧，第2、4、6、8 h呼吸空气，减压40 min。对照组大鼠造模成功3 h后，置于实验舱内不升压，呼吸常压空气9 h。

1.2 模型制作及分组 采用改良Longa线栓法[9]制作大鼠永久性大脑中动脉闭塞模型：采用0.20 mm直径的单股尼龙线制作一侧圆钝而富有弹性的小头线栓，圆钝线栓头涂以牙科专用硅胶，用以阻塞左侧大脑中动脉[6-8]。模型制备后3 h采用姿势反射实验对造模大鼠进行行为学评分[10]，评分1分或2分为造模成功，排除死亡、麻醉未清醒、无自主行动和无神经功能缺损大鼠。造模成功的大鼠按照随机数字表法分为对照组和HBO组，每组54只，于造模成功后3 h行神经功能评分。

2.3 AIF在线粒体和细胞核的表达

（1）神经功能评分：采用Garcia评分标准，该评分涉及6个方面：自发性行为、四肢活动的对称性、前爪伸展、攀爬能力、身体的本体感觉、触碰触须的反应；最高18分，最低3分，得分越高，神经功能缺损越轻[6-8，11]。

（2）凋亡细胞数：大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，生理盐水、4%甲醛灌杀，取前囟后3～6 mm处脑组织冰冻切片，厚20 μm，应用TUNEL试剂盒，依照说明书操作行染色。冰冻切片浸入通透液，冰上促渗2 min，PBS冲洗3次，滴加脱氧核糖核苷酸末端转移酶反应液，湿盒中37 ℃反应60 min，PBS冲洗3次，标记为绿色荧光的是TUNEL阳性细胞，每样本随机选取缺血半暗带5个镜下视野，计数阳性细胞数，取平均值。

模型制作失败和实验中途死亡的大鼠，剔除数据后重新补充模型，并加以统计。考虑到每只大鼠基础状态的微小差异，本研究采用神经功能评分改善情况：分别将造模后13 h、24 h、72 h处死前的Garcia评分与3 h评分相减，差值为正数表示神经功能改善，差值为负数表示神经功能恶化。

（4）MMPo：大鼠断头取缺血半暗带脑组织剪成糊糜，加入消化酶A消化25 min，制成细胞悬液，加入罗丹明123染液，按说明书操作，孵育、离心、重悬细胞培养、离心、再重悬，流式细胞仪检测罗丹明123荧光强度以观察膜电位变化情况，激发波长488～505 nm，发射波长515～575 nm。荧光值越高，表示MMPo越低，反映线粒体功能越差，正常值为1067.96。

（3）AIF在线粒体和细胞核的表达量：大鼠断头取半暗带脑组织，经漂洗、研磨、过滤、反复离心，分离线粒体及细胞核，分别加入磷酸酶抑制剂、PBS缓冲液，振荡、离心，提取线粒体及细胞核蛋白，使用AIF ELISA试剂盒按照说明书加入抗体、孵育、洗板、加入标记酶二抗再孵育、洗板，加入显色液孵育，用酶标仪在450 nm处读数，绘制标准曲线，处理数据，得到AIF各时间点分别在线粒体和细胞核的表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料符合正态分布，以形式表示，组间比较采用两独立样本t检验，组内进行单因素方差分析（ANOVA），在方差具有齐性的条件下，若各时间点之间差异具有显著性，采用Post Hoc中q检验（即Student-Newman-Keuls检验，SNK）和LSD法进行组间差异的两两比较；若方差不具有齐性，则选择非参数检验进行总体差异的比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

对照组大鼠死亡5只，13 h内2只，13～24 h、24～48 h、48～72 h内各死亡1只，经解剖证实死因为脑出血、脑水肿和蛛网膜下腔出血。HBO组治疗过程中无死亡、癫痫发生。两组大鼠3 h Garcia评分差异无统计学意义（对照组vsHBO组：8.21±0.86分vs8.43±0.81分，P=0.51）。

2.1 神经功能评分改善情况 对照组各时间点Garcia评分改善整体差异有统计学意义（P＜0.001），两两比较显示，72 h改善最显著，与13 h（P＜0.001）、24 h（P=0.003）差异均有统计学意义，13 h与24 h之间差异无统计学意义。HBO组各时间点Garcia评分改善，整体差异也有统计学意义（P＜0.001），其中72 h改善与13 h（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）差异有统计学意义，13 h与24 h之间差异无统计学意义。

HBO组较对照组13 h（P＜0.001）、24 h（P=0.04）Garcia评分改善均更多，72 h两组差异无统计学意义（表1）。

2.2 凋亡细胞数 每组大鼠缺血半暗带区皆可观察到大量凋亡细胞，对照组各时间点凋亡细胞整体差异有统计学意义（P＜0.001），两两比较显示，72 h凋亡细胞最少，与13 h（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）差异均有统计学意义，13 h与24 h之间差异无统计学意义。HBO组各时间点凋亡细胞数整体差异也有统计学意义，其中24 h较13 h凋亡细胞减少（P=0.02），72 h与13 h、24 h之间差异无统计学意义。

HBO组较对照组13 h、24 h凋亡细胞数均更少（均P＜0.001），72 h两组差异无统计学意义（表2）。

1.4 观察指标 每组54只大鼠按处死时间点分为造模后13 h、24 h、72 h亚组，每亚组18只，于处死前行神经功能评分，处死后各取6只大鼠分别用于检测凋亡细胞数、凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）在线粒体和细胞核的表达量、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMPo）三种指标。

2.3.1 AIF在线粒体的表达 如表3所示，对照组各时间点AIF在线粒体的表达整体差异有统计学意义（P＜0.001），两两比较显示，72 h最高，与13 h（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）差异均有统计学意义，13 h与24 h（P＜0.001）之间差异有统计学意义。HBO各时间点整体差异也有统计学意义（P＜0.001），其中72 h与13 h（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）差异有统计学意义，13 h与24 h之间差异无统计学意义。

HBO组较对照组13 h、24 h及72 h各时间点AIF在线粒体的表达均更高（均P＜0.001）。

2.3.2 AIF在细胞核的表达 两组AIF在细胞核中的表达趋势相同，13 h均可见升高，24 h达到高峰，72 h明显降低。如表4所示，对照组各时间点AIF在细胞核的表达整体差异有统计学意义（P＜0.001），两两比较显示，72 h最低，与13 h（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）差异有统计学意义，13 h与24 h（P＜0.001）之间差异有统计学意义。HBO各时间点差异也有统计学意义（P＜0.001），其中72 h与13 h（P＜0.001）、24 h（P＜0.001）差异有统计学意义，13 h与24 h（P＜0.001）之间差异有统计学意义。

HBO组较对照组13 h、24 h及72 h各时间点AIF在细胞核的表达均降低（均P＜0.001）。

2.4 MMPo 造模成功后13 h，对照组荧光值开始升高，24 h明显升高（P＜0.001），提示MMPo下降；72 h时恢复至13 h水平附近（P=0.10），较24 h明显下降（P＜0.001）。

其次，工作与生活的压力，是产后抑郁的重要原因。部分女性因为怀孕与分娩，可能会错失职场上升的机会，甚至会丢掉工作，加之因为宝宝的诞生，经济支出增加，会无形中给年轻妈妈增加焦虑。

HBO组荧光值相对稳定于较低水平，提示MMPo稳定于较高水平，13 h、24 h及72 h各时间点均较对照组低（均P＜0.001），提示对照组各时间点MMPo均低于HBO组（表5）。

3 讨论

HBO治疗的时间窗和剂量与其疗效及毒性密切相关，一直是HBO学界研究的焦点之一。本课题组前期通过系列动物研究发现：在大鼠永久性大脑中动脉闭塞3 h开始，采用HBO单次持续9 h治疗，一方面可提高内源性血管内皮生长因子表达，促进新生血管形成和侧支循环建立[6]，另一方面通过降低细胞色素C和caspase-3，减少细胞凋亡[8]，体现了HBO神经保护作用且并未产生额外的氧化应激等损伤，这与多数学者的观察一致[3-4]。在以上研究基础上，本研究观察了HBO通过非caspase依赖途径对细胞凋亡的影响，以进一步探讨HBO对局灶性脑梗死大鼠更多的神经保护作用机制。

2)化学疏花疏果。采用西维因600～1 200倍液，在花后1～3周喷洒，对疏除部分幼果比较有效。也可在花后2～3周喷萘乙酸2～8毫克/升，或萘乙酰胺5～17毫克/升也有一定的效果。如果把握不好浓度和时间，会影响果实发育，因此要慎用。

师：是呀，文本以第一人称介绍黑脸琵鹭，把黑脸琵鹭当做人来写，拉近了文本与读者的距离，值得借鉴。我们同学们也可以学着他的样子，让你喜欢的小动物开口说话。

表1 神经功能Garcia评分改善比较（单位：分）

表2 凋亡细胞计数比较

表3 AIF在线粒体的表达量比较（单位：ng/mL）

表4 AIF在细胞核的表达量比较（单位：ng/mL）

表5 线粒体罗丹明123荧光强度比较

对于大鼠永久性大脑中动脉闭塞模型，随时间延长，脑梗死体积会扩大，从而进一步加重神经功能缺损。分析原因，一方面是缺血半暗带细胞在缺血缺氧得不到改善时发生死亡，另一方面是缺血缺氧导致能量缺乏时，细胞发生坏死而非凋亡，细胞坏死过程中溶酶体和细胞膜破裂会释放溶酶体酶、兴奋性氨基酸等物质激活炎症反应从而使梗死体积扩大。其中，能量主要是在线粒体产生，从理论上来说，改善缺血缺氧或是改善线粒体功能都是脑梗死治疗的策略。

1.1 实验动物及试剂 选取108只SD清洁级雄性大鼠，体质量280±20 g（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），大鼠实验前禁食、不禁水3 h以上。实验试剂包括水合氯醛、蔗糖，多聚甲醛、柠檬酸钠、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）、聚乙二醇辛基苯基醚（以上北京化学试剂公司生产），以及脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）试剂盒（Cat#KGA7044）、细胞悬液制备试剂盒（Cat#KGA829）、线粒体/细胞核提取试剂盒，大鼠凋亡诱导因子ELISA试剂盒，罗丹明123染色试剂盒（Cat#KGA217）（以上南京凯基生物科技发展有限公司生产）。

本研究观察到造模成功后13 h、24 h，HBO组神经功能评分改善的程度较对照组明显，显示了HBO治疗的疗效。但两组大鼠72 h神经功能改善程度差异并不明显，考虑与对照组出现死亡大鼠剔除数据后重新补充模型，而HBO治疗后部分病重大鼠成活，从而拉低了HBO组神经功能评分有关。本研究提示HBO挽救了半暗带受损伤细胞，使之免于凋亡，减少了早期凋亡细胞，不仅与课题组前期观察结果相同，与Zhou等[12]对HBO治疗脊髓损伤的研究结果和He等[13]观察到的HBO治疗能减轻急性创伤性脑损伤的细胞凋亡也是一致的。从凋亡细胞数量看，13 h、24 h HBO组较对照组凋亡细胞数降低，而72 h两组凋亡细胞数差别不大，这与HBO组13 h、24 h神经功能改善优于对照组是相符的，考虑是因为HBO干预及时，提供了充足的氧气，一方面早期挽救了缺血周围区部分休眠细胞，减少了13 h、24 h的凋亡细胞数，从而保留了相应支配区神经功能，所以13 h、24 h可见HBO组大鼠神经功能恢复较好。同时HBO治疗后线粒体功能得以恢复，产生足够能量，使不可挽救的脑细胞发生凋亡而非坏死，使得72 h凋亡细胞数有回升趋势，同时避免细胞发生坏死而加剧神经功能缺损恶化。

大学生是国家的未来和民族的希望，其身体素质和健康状况直接关乎国家的兴衰发展。目前，我国开展了大、中、小学生的体质健康状况调查，但高职院校学生体质健康状况的调查却较少。大多数高职院校学生毕业后即将走向社会，比其他学生更早的接触社会，高职院校学生的体质健康状况，是学生体质健康工作的重要组成部分。本研究于2014年对河南省高职院校在校学生体质健康检测资料进行分析，旨在了解和掌握高职院校学生的体质健康水平，为更好的开展河南省学校卫生工作，制定促进职高职院校学生体质健康的措施提供科学依据。

从凋亡路径来说，有caspase依赖性和非依赖性两种线粒体凋亡。细胞色素C和caspase-3都是与caspase依赖性途径有关的促凋亡因子[8，14-15]，caspase-3激活后，一方面直接降解多聚（ADP-核糖）聚合酶、蛋白激酶C等底物，另一方面激活其他的caspase蛋白酶类，共同参与底物的降解，直接启动凋亡。本课题组前期亦有研究证实，HBO抑制caspase-3的释放[8]。AIF等则主要引发非caspase依赖性凋亡途径[15-16]。本研究观察到：大鼠缺血后，AIF由线粒体向细胞核转移，而AIF再次稳定于线粒体时与病情好转、MMPo趋向于接近正常水平几乎是同步的，两组比较，HBO组MMPo维持在一个较高水平，AIF的核转移降低，考虑HBO治疗改善了氧供，线粒体功能得以恢复，一方面产生足够的能量使细胞发生凋亡而非坏死，另一方面稳定了MMPo，阻碍了AIF由线粒体向细胞核转移，从而抑制了AIF介导的非caspase依赖性凋亡途径，减少了细胞凋亡。高压氧治疗使细胞缺血缺氧状态得到改善，细胞恢复正常功能，神经功能缺损也相应得到改善。由此可见，虽然HBO治疗只持续9 h，并间断吸氧，但是明显改善了缺血后大鼠脑组织缺血缺氧状态，抑制了病理进展，发挥了神经保护作用。

本研究尚存以下局限：①样本量小；②为观察和统计学方便，取了固定时间点取材，但是观察时间点与某些因子变化趋势可能不太一致；③研究中缺血半暗带取材是固定的，但它是一个动态变化区域，每只大鼠间也可能存在差异，所以取材定位与实际可能存在差异。

在ISO24444：2010关于防晒化妆品防晒指数测定方法中规定，可根据测定ITA°快捷准确地预测受试者的 MED，因此参考引用 ISO24444：2010修改的《化妆品安全技术规范》（2015年版）也明确提出“可以根据受试者肤色 ITA°预测受试者 MED值”。

二是“合作组织模式”。多途径推进政府、学校、行业、企业等主体参与贫困地区新型职业农民培育工作。特别是发挥农业主管部门、农业院校或农广校、乡镇企业等机构的积极性，利用不同主体间的资源优势形成合力。

【点睛】本研究证实早期单次长时间高压氧治疗可以改善大鼠神经功能，稳定线粒体膜电位，抑制凋亡诱导因子由线粒体向细胞核转移，从而影响细胞的凋亡，达到神经保护作用。