非极性柱下保留指数结合GC-MS/MS 分析烟草香味成分

任宗灿，陈 黎，史天彩，王晓瑜，崔华鹏，谢复炜，刘惠民

中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

烟草香味成分既是烟叶又是卷烟风格和品质的物质基础。获得正确的烟草香味成分定性、定量分析数据对卷烟风格剖析、卷烟产品的安全控制至关重要。目前行业普遍采用GC-MS 法结合通用型商业GC-MS 谱库对烟草香味成分进行定性分析［1-4］。由于烟草中成分极其复杂、质量分数差异较大，常有重叠峰出现，GC-MS 法需要进行解卷积扣除背景等处理以提高谱库匹配的准确性［5-6］。对于低质量分数、多指标的检测方法，该过程既显得繁琐复杂，又难以实现可靠的高匹配度结果。GC-MS/MS 法灵敏度高、检出限低、定性准确、抗干扰能力强，可以将在色谱分离过程不能完全分开的具有不同母离子的共流出物通过设置动态多反应监测模式（dMRM）分离［7-8］。目前已有报道采用GC-MS/MS 法测定烟草香味成分，但覆盖目标物种类及数量皆较少［9-10］。dMRM 模式的定性依据是目标物的保留时间和特征离子对信息，目标物的准确保留时间及离子对信息需通过标准品获取。但烟草成分中含有大量的同分异构体及结构近似的香味成分，人工合成的标准品也常为异构体混合物，异构体质谱图之间差别不明显，仅依据谱图匹配结果无法明确标准品中色谱峰的归属，导致异构体之间难以区分。另一方面，在实验室日常检测中，当仪器维护（如更换或切割色谱柱）后，目标物保留时间会发生改变。多靶标的GC-MS/MS 法由于目标物繁多、扫描信息少（仅为特征离子对信息，无法进行谱图匹配）以及扫描时间窗口窄（目标物保留时间偏离出时间窗口则无法进行扫描采集）等问题导致重新确定目标物的保留时间会耗费大量时间及精力。

保留指数（Retention index, RI）的概念由Kovats 在1958 年提出［11］。RI 表示物质在固定液上的保留值行为，当固定相确定时，物质的RI 与柱温成线性相关且毛细管色谱柱的极性越小RI 的重现性越好［12］。即当色谱条件确定时，目标物的RI为与其保留时间有关的常数。基于此原理，在复杂样品体系中，采用RI 结合GC-MS 谱库匹配可以明显提高同分异构体定性结果的准确性和可靠性。利用GC-MS 法结合RI 进行定性分析已广泛应用于食品、香精香料和烟草等领域［12-17］。然而通用型商业GC-MS 谱库RI 信息不全，往往导致一些重要烟草香味成分无法被准确定性；另一方面，由于RI 具有良好的稳定性，且RI 与保留时间之间又存在一一对应关系，在多靶标GC-MS/MS 方法中，利用RI 可以快速调整目标物的扫描时间窗口。在烟草领域，RI 多被应用于辅助定性分析目标成分，而利用RI 确定多靶标GC-MS/MS 法采集时间窗口的研究鲜有报道。因此，通过检测标准品确定了241 种烟草香味成分的RI，并探究了其在确定GC-MS/MS 方法采集时间窗口中的应用，旨在为烟草香味成分的快速分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

2016 年云南曲靖产C3F 等级K326 烟叶样品。4 种检测用烟叶样品：1#为2015 年云南产清香型B2F 等级CB-1 烟叶，2#为2015 年云南产清香型X2F 等级CB-1 烟叶，3#为2015 年河南产浓香型B2F 等级中烟100 烟叶，4#为2015 年河南产浓香型X2F 等级中烟100 烟叶。

QuEChERS 萃取试剂盒（4 g 硫酸镁+ 1 g 氯化钠，美国Agilent 公司）；过滤工具包（尼龙，13 mm×0.22 µm）；241 种标准品（标准品信息见表1）；苯乙酮-d8（98 atom% D）、正构烷烃标准品C7～C40（美国Sigma-Aldrich 公司）；磷酸（AR，天津市科密欧化学试剂有限公司）；磷酸二氢钠（AR，天津市致远化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，美国J T Baker 公司）。

7890B-7000D 气相色谱/三重四极杆质谱联用仪（美国Agilent 公司）；EOFO-945066 多管式旋涡混合器（美国Talboys 公司）；3-30KS 高速冷冻离心机（德国Sigma 公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）；CPA225D 电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius 公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

内标工作溶液：准确称取30 mg 的苯乙酮-d8标准品，然后用乙腈溶解并定容至10 mL，得3 000 mg/L 的内标储备液，于-18 ℃冰箱中储存；取0.1 mL 内标储备液于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配制成30 mg/L 的内标工作液。

混标工作液：准确称取100 mg 标准品（精确至± 0.1 mg），用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成10 000 mg/L 的单标储备液。准确移取0.1 mL 各单标储备液于50 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配制成20 mg/L 的混标工作液。

1.2.2 样品前处理

将实验所用烟叶研磨成粉，过孔径0.450 mm（40 目）筛。准确称取2 g 样品于50 mL 具塞离心管中，依次加入0.1 mL 混标工作液、10 mL 磷酸盐缓冲溶液，以使样品完全浸润，静置20 min。加入0.1 mL 内标工作液、10 mL 乙腈，以2 500 r/min 涡旋萃取2 min，随后放入－18 ℃的冰箱中冷冻10 min。取出后加入4 g 无水硫酸镁、1 g 氯化钠并迅速剧烈摇晃，再以2 500 r/min 涡旋2 min，8 000 r/min 离心3 min。取1.5 mL 上清液，加入0.2 g 无水硫酸镁，立即以2 500 r/min 涡旋2 min，8 000 r/min离心3 min；将上清液过0.22 μm 有机相滤膜，进行GC-MS/MS 检测。分析条件：

色谱柱：DB-5MS UI 弹性石英毛细管柱（60 m× 0.25 mm × 0.25 μm），进样口端串联预柱（5 m ×0.25 mm）；进样口温度：290 ℃；程序升温：50 ℃min）；进样模式：不分流进样，不分流时间1 min；载气：氦气（99.999%）；恒流流速：1.5 mL/min；进样量：0.8 μL。电离模式：电子轰击（EI）；电离能量：70 eV；灯丝电流：35 μA；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；传输线温度：280 ℃；Q2 碰撞气：氮气（99.999%），流量1.5 mL/min；淬灭气：氦气（99.999%），流量2.25 mL/min；扫描方式：动态多反应监测（dMRM）。

2 结果与讨论

2.1 241 种烟草香味成分RI 的测定

241 种烟草香味成分选自美国烟草添加剂清单［18］、BAT 烟草添加剂清单［19］、英国烟草添加剂清单［20］，包含了醛、酮、醇、酚、烃、醚、酯、内酯、吡啶和吡嗪等挥发性、半挥发性香味成分、潜香成分。

在程序升温条件下，目标化合物RI 的计算采用正构烷烃系列作为参考，计算公式为：

式中：x、z、z+1 分别为目标化合物以及其流出前后相邻正构烷烃的碳原子数，t（x）、t（z）、t（z+1）分别为目标化合物以及其流出前后相邻正构烷烃的保留时间。241 种烟草香味成分RI 的测定结果见表1，RI 和RI*分别为本实验测得的和NIST 库中非极性柱上的程序升温保留指数。可知，212 种目标化合物的RI 与RI*差值皆小于10，表明目标物在非极性柱上的重现性良好，实验所得RI 数据可以为非靶标检测方法提供辅助定性依据。此外，本实验中新补充了25 种NIST17 库中未收录成分的RI，其中包括一些重要的香味成分，如西瓜酮和1-（2,6,6-三甲基-2-环己烯基）-1-戊烯-3-酮等。

表1 241 种目标成分的预测保留时间和实际测得保留时间①Tab.1 Predicted retention times and measured retention times of 241 target components

表1 （续）

表1 （续）

表1 （续）

表1 （续）

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2.2 RI 在同分异构体区分中的应用

烟草基质是化学组成极其复杂的体系，其中含有大量的同分异构体。通常所购买的标准品也为异构体混合物。同分异构体的结构相似，质谱图差别不大，仅依靠谱图匹配难以区分标准品中的同分异构体，而结合RI 辅助定性可以明显提高结果的准确性。例如柠檬醛包含顺式和反式两种构型，即橙花醛（编号213）和香叶醛（编号216），天然提取及化学合成的柠檬醛皆为两种异构体的混合物。柠檬醛标准品的总离子流图及色谱峰1和2 所对应的质谱图如图1 所示。NIST 谱库检索结果表明：峰1 与橙花醛和香叶醛的匹配度分别为86%和85%，峰2 与橙花醛及香叶醛的匹配度分别为84%和85%。因此无法通过谱图匹配来确定两者的色谱峰。文献［21］报道，橙花醛与香叶醛的RI 分别为1 232 和1 266，即出峰顺序为橙花醛在前、香叶醛在后，由此可初步判定柠檬醛标准品总离子流图中峰1为橙花醛、峰2为香叶醛。且由本实验所测峰1及峰2的RI分别为1 234和1 263，与文献值相近，进一步确认峰1为橙花醛、峰2为香叶醛。

图1 柠檬醛标准品总离子流图（a）以及色谱峰1（b）和色谱峰2（c）的质谱图Fig.1 Total ion current chromatogram of citral (a) and mass spectra of chromatographic peaks 1 (b) and 2 (c)

某些香料不同构型的异构体对于烟气香吃味的影响不同。天然玫瑰醚为顺式结构，人工合成的玫瑰醚一般为异构体的混合物。与反式玫瑰醚相比，顺式玫瑰醚的玫瑰香味更强烈，香味阈值更低。合成的玫瑰醚中顺式结构的质量分数越高香气越好，因此检测时需要对两者进行明确区分。玫瑰醚标准品的总离子流图及色谱峰所对应的质谱图见图2，谱图匹配显示标准品中两个色谱峰皆为顺式玫瑰醚。实测两峰对应化合物的RI 分别为1 108、1 124，既往报道称顺式玫瑰醚［22］和反式玫瑰醚［23］的RI 分别为1 109 和1 126，因此可以确认峰1 和峰2 分别为顺式和反式玫瑰醚。

图2 玫瑰醚标准品总离子流图（a）以及色谱峰1（b）和色谱峰2（c）的质谱图Fig.2 Total ion current chromatogram of rose oxide (a)and mass spectra of chromatographic peaks 1 (b) and 2 (c)

2.3 RI 在dMRM 方法时间窗口校正中的应用

在超多靶标分析方法中，大量时间窗口的互相重叠、堆积会导致每对离子对的驻留时间缩短，使采集的色谱峰数据点减少，甚至无法采集数据。因此，为了保证色谱峰有足够的数据点且每对离子对有足够的驻留时间，一般会尽可能缩小时间窗口，如本方法中各目标物时间窗口仅为0.6 min，即仪器仅在各目标物保留时间前后0.3 min内扫描其特征离子对。在多靶标dMRM 方法实验室日常检测中，仪器常规维护（如更换或切割色谱柱）后，目标物的保留时间会发生漂移，时常出现目标物色谱峰偏移出时间窗口而无法采集数据的情况，影响方法的定性定量结果。由于目标物众多且保留时间的重叠干扰，若采用全扫描模式确定各目标物准确保留时间则需要分组进样检测，实验过程及数据处理花费时间长。利用所建立的RI 库可以快速、准确地获得各目标物的保留时间，大大减少保留时间校正的工作量。

在更换色谱柱后，首先采用相同的程序升温条件对正构烷烃混合标准工作液进行全扫描检测，获取正构烷烃的保留时间。其次将各目标物的RI 及其相邻正构烷烃的保留时间代入公式（1）获得241 种烟草香味成分的计算保留时间。最后以计算保留时间±0.3 min 创建时间窗口，建立dMRM 方法对目标物混标工作液进行检测，获得各目标物的准确保留时间。根据计算保留时间所创建的时间窗口能否覆盖目标物的准确保留时间判定该方法是否可行。各目标物计算保留时间与准确保留时间的结果见表1。可知，241 种目标物计算保留时间与准确保留时间的差值皆小于0.3 min，其中232 种的 差 小于0.05 min、9 种 的差在0.05 ～0.10 min 内。各目标物准确保留时间皆在依据计算保留时间所建立的时间窗口范围内。证明利用所建立的RI 库快速确定目标物保留时间可行。该策略可以有效缩短实验室日常维护工作时长，也可以在无标准品的情况下建立烟草香味成分的dMRM 分析方法。

2.4 实际样品检测结果分析

利用化合物的RI 信息建立针对烟草241 种香味成分的dMRM 定性分析方法，并检测了4 个烟叶样品，共检测出89 种化合物（表2），以此针对性地完善靶向定量方法。在4 种烟叶样品中巨豆三烯酮的质量分数最高，其次是1-（2,6,6-三甲基-2-环己烯基）-1-戊烯-3-酮、3-甲基-2,5-呋喃二酮、地芰普内酯、苯乙醛和2（5H）-呋喃酮。

表2 4 种烟叶样品的检测结果Tab.2 Detection results of 4 tobacco leaf samples

表2 （续）

3 结论

通过RI 概念结合GC-MS/MS 技术建立了针对241 种烟草香味成分的检测方法，探究RI 在该方法中的应用：①建立了针对DB-5MS UI 色谱柱的RI 库，包括241 种烟草香味成分，其中25 种成分的RI 还未被NIST17 收录，完成了部分同分异构体RI 值的确认，可为烟草香味成分分析提供参考；②提出了利用RI 快速准确矫正dMRM 扫描时间窗口的方法，缩短了多靶标检测方法实验时长；③探索了一种根据RI 建立烟草香味成分定性检测方法的新策略，有助于在无靶标的未知盲样检测工作中快速筛选靶标，针对性地建立定量方法，有效降低实验成本。