烟草秸秆废弃物中纤维素降解菌的筛选、鉴定及产酶条件优化

梅金飞，刚利萍，余梅霞，徐华杰，吴福芳，戴 亚，盛良全*

1. 阜阳师范大学，安徽省阜阳市清河西路100 号 236037

2. 重庆中烟工业有限责任公司技术研发中心，重庆市南岸区南坪东路2 号 400060

烟草秸秆中含有大量有机物和矿物质，其中氮含量0.5%～1.2%，磷含量0.10%～0.25%，钾含量0.8%～1.8%［1-2］。因此，合理利用烟草秸秆是烟草废弃物再利用的重点工作之一。目前已筛选出多种微生物菌株用于农作物秸秆的降解。邹芳等［3］从皖南地区烟稻轮作田土壤中筛选出产纤维素酶活性较高、相对耐热耐碱且对烟杆有一定分解作用的降解菌YC-2；付丽等［4］以秸秆为唯一碳源从土壤中筛选出3 株具有秸秆降解能力的菌株；Bano 等［5］利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）KIBGE-HAS 降解甘蔗渣生产纤维素降解酶；Dar等［6］从棉铃虫肠道中筛选出纤维素降解菌克雷伯菌（Klebsiella sp.）MD21，可用于生物秸秆降解和制浆工业；Hussain 等［7］从家禽房土壤中分离出产纤维素酶的细菌，将植物秸秆废弃物降解转化为有利用价值的化合物；杨雪梅等［8］从腐殖质中分离出高产漆酶的木质素降解菌，其液态发酵液对烟秸秆粉末降解30 d 后失重率50%、木质素降解率39.39%、纤维素降解率36%。该真菌菌株产酶量高，对烤烟秸秆降解能力较强。王海滨等［9］筛选得到弗留明拜叶林克氏菌（Beijerinckia fluminensis）XM-3 在固态发酵20 d 后对苦参残渣和稻秆的降解率分别达31.4%和63.1%。孙玲等［10］筛选出的黄杆菌（Flavobacterium banpakuense）CMC-I，在固体发酵10 d 后对玉米秸秆的降解率可达24. 14%。王天生等［11］筛选出的菌株DX-5 和DX-9 按照2∶3 进行组合后的复合菌系纤维素降解率高达87.96%。在烟草秸秆废弃物的研究方面，万兵兵等［12］从烟草根际中筛选出具有解磷释钾功能的微生物可用于烟草秸秆的降解；陈兴等［13］从陈化烟叶中分离到纤维素（CMC）酶活性较高的菌株CE1，可促进烟叶中纤维素转化为水溶性糖类；Zhang 等［14］从烟草根际中筛选出高效解钾菌，能够在固体和液体培养基中溶解钾长石粉；谢雨歆等［15］从烟草根际土壤中分离筛选出促生性好且相互之间不存在拮抗作用的产吲哚乙酸菌、溶磷菌和解钾菌。另外，从自然界分离筛选出的菌株产纤维素酶活性普遍较低，纤维素降解菌发酵条件又直接影响其纤维素酶活性，进而影响菌株对秸秆纤维素的降解。因此优化菌株的产酶条件尤为必要。郭爱莲等［16］对产黄纤维单胞菌（Cellulomonas flavigena）的培养时间、温度、培养基pH、碳氮源等培养条件进行优化，CMC 酶活性可达48.64 U/mL；宋桂经等［17］对芽孢杆菌接种量、温度、培养基初始pH、时间等条件进行优化，使酶活性由初筛时的3.4 U/mL 提高到6.0 U/mL；韩学易等［18］通过对温度、培养基初始pH、培养时间、不同的碳源和氮源等对枯草芽孢杆菌进行产纤维素酶条件优化，产纤维素酶活性由68.5 U/mL 提高到196.33 U/mL；金 迪 等［19］对 贝 莱 斯 芽 孢 杆 菌（Bacillus velezensis）JMD11 进行产纤维素酶条件分析表明，菌株在初始培养基pH 7.0、培养温度28 ℃发酵32 h 后，酶活性达260.32 U/mL。但从烟草秸秆中筛选的既能高效降解秸秆纤维素同时又能释放秸秆中磷与钾元素的降解菌研究与应用尚鲜见报道。为此，进行了烟草秸秆废弃物中纤维素降解菌的筛选及产纤维素酶条件优化，旨在为烟草秸秆废弃物中纤维素的有效降解和秸秆生物有机肥料的高效利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

在安徽省阜阳市颍泉区插花镇烟叶产区采集烟草的茎叶，自然堆置3～5 个月，粉碎后保存到无菌袋中备用。对照菌株高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）WGS-12 由阜阳师范大学微生物实验室提供，以下简称WGS-12。

试验用培养基包括初筛培养基、甲基纤维素钠（CMC-Na）培养基、羧甲基纤维素酶活（CMCase）培养基、滤纸酶活（FPase）培养基［20］、有机磷固体（液体）培养基、无机磷固体（液体）培养基、解钾菌分离培养基、解钾菌发酵培养基［21］、秸秆液态发酵培养基（烟草秸秆10.0 g/L；（NH4）2SO4，2.0 g/L；K2HPO4，1.0 g/L；KH2PO4，1.0 g/L；MgSO4，0.2 g/L；CaCl2，0.1 g/L；FeSO4，0.05 g/L；MnSO4，0.02 g/L）。

试剂主要有3，5-二硝基水杨酸［98%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司］、酒石酸锑钾（98.8% 天津博迪化工股份有限公司）、四苯硼酸钠（AR 99% ，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、抗坏血酸（C6H8O6，左旋）（99.7%，天津博迪化工股份有限公司）、羧甲基纤维素钠（≥99.0%，北京百灵威科技有限公司）、刚果红（中国远航试剂厂），其他常规试剂均为上海国药集团化学试剂有限公司生产的分析纯。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离与纯化

按照稀释涂布平板法［22］进行烟草秸秆细菌的分离。取10.00 g 烟草茎叶粉末装入到已灭菌锥形瓶中，加入100 mL 已灭菌的二次蒸馏水，放在振荡器中振荡浸取24 h 后，吸取浸取液并稀释10倍、100 倍和1 000 倍。吸取稀释后不同倍数浸取液，分别在初筛培养基上涂布培养。挑取在初筛培养基上不同形态菌株至LB 培养基进行分离纯化。

1.2.2 高效纤维素降解菌的筛选

挑取对照菌WGS-12 和获得的单菌落接种在CMC-Na 培养基上，37 ℃环境中培养3 d。用刚果红溶液染色15 min 后，加入氯化钠溶液漂洗，并测定降解圈直径与菌落直径，通过降解圈直径与菌落直径的比值大小，比较菌株降解纤维素能力强弱，比值越大说明纤维素降解能力越强［23］。

1.2.3 纤维素酶活性的测定

采用DNS 法［24］测定纤维素酶活性，单位定义为每毫升粗酶液在1 min 内催化底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量为1 个酶活性单位（U）。

1.2.4 解磷释钾能力的测定

1.2.4.1 解磷能力的测定

挑取对照菌WGS-12 和目标菌株（编号SL-3A）单菌落接种到有机磷（或无机磷）固体培养基上，在37 ℃条件下培养3 d。观察解磷圈产生的情况，测量并记录解磷圈直径（H）。

挑取对照菌WGS-12 和SL-3A 单菌落接种到50 mL 有机磷（或无机磷）液体培养基中，以不接菌为空白对照，摇床转速为180 r/min，37 ℃培养3 d，培养液于10 000 g 离心10 min，取上清液采用钼锑抗比色法测定培养液中有效磷含量（质量分数）［25］。

1.2.4.2 释钾能力的测定

将对照菌WGS-12、SL-3A 和大肠杆菌（Escherichia coli）单菌落接种到解钾菌分离培养基上，放置于37 ℃环境中培养，每天观察，菌株在解钾菌分离培养基上能生长视为有解钾活性，即为解钾菌。

挑取对照菌WGS-12、SL-3A 和大肠杆菌（Escherichia coli）单菌落接种到解钾菌发酵培养基中，以不接菌为空白对照，摇床转速为180 r/min，37 ℃培养3 d，培养液于10 000 g 离心10 min，取上清液，采用四苯硼钠法测定培养液中有效钾含量（质量分数）［26］。

1.2.5 菌株鉴定

形态特征与生理生化特性：LB 平板培养观察菌落的大小、颜色、表面和边缘形状，并对菌体进行革兰氏染色［27］。

分子生物学鉴定：菌株送北京睿博生物科技有限公司测序，采用BLASTN 软件与EZbiocloud网站对SL-3A 菌株的16S rDNA 部分序列进行同源性比对，用MEGA 5.0 软件进行系统发育分析，并构建系统发育树［21］。

1.2.6 产纤维素酶条件优化

采用单因素试验考察培养时转速、温度、菌液接种体积、初始pH、氮源、碳源及碳氮比对菌株产纤维素酶的影响，并确定较佳发酵条件［28］。

1.2.7 秸秆降解效果

将纯化后的SL-3A 菌株和对照菌WGS-12 接种到LB 液体培养基中，并在37 ℃条件下振荡（180 r/min）过夜培养，将其用作秸秆液态发酵降解实验和CMCase 发酵实验种子液。

准确称取1.00 g 烟草秸秆，按不溶性碳为1%的浓度制备秸秆液态发酵培养基，将SL-3A 和对照菌WGS-12 种子液按8%体积比接种到秸秆液态发酵培养基中，37 ℃，200 r/min 培养15 d，并在第3、6、9、12 和15 d 过滤出发酵培养基中秸秆，并在105 ℃下烘干至恒质量。发酵前后秸秆质量之差即为秸秆降解质量，并计算出秸秆降解率。

1.2.8 降解菌剂在秸秆堆肥中的应用

参照诸葛诚祥［28］的方法构建高效降解菌剂，利用优化后的SL-3A 产纤维素酶培养条件对SL-3A 菌株进行CMCase 发酵培养，作为自制降解菌剂。将构建的自制降解菌剂和外购菌剂（EM 菌液 佛山市南海禅泰动物药业有限公司）进行秸秆堆肥试验，并在堆肥过程中取样，用元素分析仪（Elementar vario EL cube，德国元素分析系统公司）测定全碳与全氮，参照田维亮等［29］方法测定粗纤维素含量（质量分数）。在堆肥开始与结束后采用Mchlich-3 萃取法进行样品磷和钾的提取，分别用钼锑抗比色法和电感耦合等离子发射光谱仪（PerkinElmer Optima 8000，美国珀金埃尔默股份有限公司）测定有效磷和有效钾含量（质量分数）［30］。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的初步筛选

从烟草茎叶粉末中初筛得到21 株细菌，将21株细菌纯化保存。21 株菌株与对照菌WGS-12 在CMC-Na 培养基都能够生长，经刚果红染色后均产生明显的纤维素降解圈，根据降解圈直径与菌落直径的比值大小（图1），筛选出1 株降解纤维素能力较强菌株，编号为SL-3A，其降解圈直径与菌落直径比值为7.67±0.40，对照菌WGS-12 降解圈直径与菌落直径比值为3.17±0.54。

图1 SL-3A 与对照菌WGS-12 的降解能力比较Fig.1 Degradation abilities of SL-3A (left) and the control strain (WGS-12，right)

2.2 纤维素酶活性分析

CMCase 与FPase 酶活性检测结果见图2。加入SL-3A 菌株的发酵液中CMCase 与FPase 酶活性均随培养时间的增加呈现出先升高后降低的趋势。CMCase 和FPase 酶活性在培养第3 天时达到高峰，分别为96.98 U 和70.43 U，而加入对照菌株的发酵液中CMCase 与FPase 酶活性在培养第3 天时分别为52.61 U 和24.33 U，因此SL-3A 菌株纤维素酶活性明显优于对照菌WGS-12。

2.3 解磷释钾能力分析

2.3.1 解磷能力分析

SL-3A 菌株解磷能力见表1。加入SL-3A 菌株的培养基中有机磷含量为40.54 mg/L，无机磷含量320.88 mg/L。而加入对照菌WGS-12 的培养基中有机磷含量为10.83 mg/L，无机磷含量95.52 mg/L。可见，SL-3A 菌株具有解磷能力且优于对照菌WGS-12。

表1 SL-3A 解磷能力分析Tab.1 Ability of SL-3A to dissolve phosphorus

图2 不同培养时间SL-3A 与对照菌WGS-12 的纤维素酶活性比较Fig.2 Cellulase activities of SL-3A (left) and the control strain (WGS-12，right) at different culture time

2.3.2 解钾能力分析

按1.2.4.2 中方法将SL-3A 和对照菌WGS-12单菌落接种到解钾分离培养基上，对照菌WGS-12 和大肠杆菌（Escherichia coli）未见其生长，接种的SL-3A 能生长。说明SL-3A 具有解钾菌特性。从表2 看出，SL-3A 菌株解钾能力较强，接种大肠杆菌（Escherichia coli）钾含量为6.76 mg/L，而对照菌株钾含量为10.96 mg/L。

表2 SL-3A 解钾能力分析Tab.2 Ability of SL-3A to release potassium

2.4 菌株鉴定

2.4.1 菌株的形态特征与生理生化特性

菌株SL-3A 在培养基上过夜培养后，形成的菌落呈梅花状，表面湿润光滑，乳黄色，不透明。SL-3A 菌体经革兰氏染色，呈阳性，杆状或短链排列，见图3。

2.4.2 分子生物学鉴定

菌株SL-3A 的序列长度为873 bp，使用BLASTN 软件和EZbiocloud 网站对SL-3A 菌株的16S rDNA 部分序列进行同源性比对，并构建系统发 育 树，见 图4。 图4 显 示，菌 株SL-3A 的16SrDNA 与枯草芽孢杆菌高度相似。结合形态学和16SrDNA 序列分析，SL-3A 菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SL-3A，菌株SL-3A 已保存于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏号为CGMCC No.60629。

图3 SL-3A 的形态特征与生理生化特性Fig.3 Morphological characteristics and physiological-biochemical characteristics of SL-3A

图4 SL-3A 的系统发育分析Fig.4 Phylogenetic tree of SL-3A

2.5 SL-3A 产纤维素酶条件优化

2.5.1 摇床转速

在菌株培养过程中，摇床转速的大小会影响菌株与营养物质的接触，同时还影响着菌株与氧气的接触。转速过高与过低都会影响其产纤维素酶效果［28］。随着培养转速的增加，此细菌产纤维素酶能力先升高后下降，当培养转速为200 r/min时，菌株SL-3A FPase 与CMCase 达到较高，分别为40.19 U 和126.48 U。表明该菌的适宜产纤维素酶转速为200 r/min。

2.5.2 产酶温度

在不同温度的环境下，菌株的生长和产纤维素酶能力有所不同［28］。SL-3A 在27～60 ℃内均可产纤维素酶（图5），且随着培养温度的升高，产纤维素酶能力先上升后下降，当温度为37 ℃时，菌株SL-3A 产纤维素酶能力达较高水平。可见，菌株SL-3A 发酵产纤维素酶的较适宜温度为37 ℃。

2.5.3 接种体积

接种体积小会造成菌体数量较少，菌株产纤维素酶量较低;而接种量偏大，菌体数量过多时会造成营养不足，也限制了菌体的生长，产纤维素酶量也同样偏低［18］。在接种体积8%时，FPase 与CMCase 出现最高值，分别为87.76 U 和149.34 U；接种体积为2%时产纤维素酶量出现最低值，FPase 与CMCas 分别为44.62 U 和92.92 U，因此较佳产纤维素酶接种体积范围为6%～8%。

2.5.4 初始pH

细菌生长初始的酸碱度会影响其对周围营养物质的吸收［19］。培养基初始pH 对菌SL-3A 的生长有明显影响（图5），初始pH 在5.0～9.0 范围内，菌株生长良好，且宜适生长的初始pH 为7.0。

2.5.5 发酵培养基氮源

由图6 可见，蛋白胨为氮源，FPase 与CMCase分别达到89.97 U 和150.44 U；（NH4）2SO4为氮源时FPase 与CMCase 为27.65 U 和93.66 U；尿素为氮 源 时，FPase 与CMCase 可 分 别 达 到23.23 U 和43.51 U。当蛋白胨为氮源时菌株SL-3A 产纤维素酶能力高于尿素和（NH4）2SO4。因此蛋白胨氮源更为有利。

图5 SL-3A 产纤维素酶条件优化Fig.5 Optimization of cellulase production conditions for SL-3A

图6 SL-3A 发酵培养基条件优化Fig.6 Optimization of fermentation medium conditions for SL-3A

2.5.6 发酵培养基碳源

由图6 可见，羧甲基纤维素钠为碳源时，CMCase 与FPase 分别达到154.50 U 和93.66 U；葡萄糖为碳源时，CMCase 与FPase 分别为123.90 U和60.10 U；烟草秸秆为碳源时，CMCase 与FPase分别达到100.65 U 和52.65 U。羧甲基纤维素钠为碳源的CMCase 与FPase 高于其他两种碳源。因此羧甲基纤维素钠碳源更为有利。

2.5.7 发酵培养基碳氮比

由图6 可见，C/N 为2∶1 时，CMCase 与FPase分 别 达 到169.25 U 和44.99 U；C/N 为1 ∶1时，CMCase 与FPase 分别达到148.97 U 和97.35 U；C/N 为1 ∶2 时，CMCase 与FPase 分 别 达 到133.48 U和112.83 U。C/N 为2∶1 的CMCase 酶活性高于其他两种碳氮比，因此发酵培养基C/N 为2 ∶1 更为有利。

2.6 SL-3A 对烟草秸秆的降解效果

图7 SL-3A 对秸秆的降解效果Fig.7 Degradation effect of SL-3A on tobacco stalks

液态发酵培养下，对照菌株和SL-3A 菌株对烟草秸秆降解率均有显著增加，大致趋势为先快后慢，见图7。但SL-3A 菌株与对照菌WGS-12 处理烟草秸秆有显著差异，在液态发酵第15 d，对照菌WGS-12 对秸秆降解率为16.84 %，而SL-3A 对秸秆的降解率高达20.85 %。可见SL-3A 对烟草秸秆降解效果明显优于对照菌WGS-12。

2.7 SL-3A 在秸秆堆肥中的应用效果

SL-3A 菌剂在烟草秸秆堆肥41 d 后，粗纤维降解率为34.62 %，而外购菌剂粗纤维降解率为28.19 %，见图8。C/N 初始为17.77，经过SL-3A 菌剂41 d 堆肥发酵后C/N 为14.12，经外购菌剂41 d堆肥发酵后C/N 为15.40。堆肥41 d 后，有效磷含量增加0.13 %，有效钾含量增加2.12 %。

图8 秸秆堆肥中粗纤维素含量和碳氮比比较Fig.8 Crude fiber content (left) and carbon nitrogen ratio (right) in tobacco stalk compost

3 结论

从安徽省阜阳市颍泉区插花镇烟叶产区烟草秸秆中筛选出1 株具有解磷释钾功能的纤维素降解菌，经形态学和分子生物学鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SL-3A。温度、培养基初始pH、培养时间、不同碳源、氮源与碳氮比等因素对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SL-3A 产纤维素酶有明显影响。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SL-3A 较佳发酵条件为：羧甲基纤维素钠为碳源，蛋白胨为氮源，碳氮比为2 ∶1，发酵时间3 d，温度37 ℃，初始pH 为7，接种量8 % ，转速200 r/min。优化发酵条件后，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SL-3A 产纤维素酶活性由优化前的96.98 U 提高至169.25 U，较原始酶活性提高了174.52%。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SL-3A 液态发酵15 d 时烟草秸秆的降解率达20.85%。在烟草秸秆初步堆肥试验中，粗纤维降解率34.62%，有效磷含量增加0.13%，有效钾含量增加2.12%。