芒果苷改善过氧化氢诱导帕金森细胞模型的氧化应激损伤

王晓娜，许丽娜

芒果苷是芒果叶中的主要活性物质，是一种天然多酚类化合物[1]。芒果苷在抗氧化、神经保护、抗炎、免疫调节、抗肿瘤和镇痛等方面均具有一定的活性[2-5]。帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种神经退行性疾病，其临床症状包括运动迟缓、姿势步态异常、肌强直和静止性震颤等[6]。PD的主要病理特征是中脑黑质致密部多巴胺神经元的变性死亡。PD与遗传、环境因素、感染、衰老、氧化应激和神经营养因子缺乏等密切相关[7]。疾病状态下，细胞内的抗氧化能力降低、受损，因为羰基的增多及自由基清除不完全造成不同程度的氧化应激损伤[8]。人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y是一种分化程度较低的肿瘤细胞，在细胞形态、生理和生化功能等方面与正常神经细胞相似，广泛应用于神经系统疾病药物筛选和发病机制研究[9]。本实验采用过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）诱导SH-SY5Y细胞建立帕金森细胞模型，评价芒果苷对PD的保护作用并探讨可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞购自中国科学院上海生命科学研究所细胞库。芒果苷购自成都普利斯生物科技有限公司；胎牛血清购自Gibco公司；MEM/F12高糖培养液购自江苏凯基生物有限公司；噻唑蓝（MTT）购自武汉博士德生物工程有限公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙 二 醛（maleic dialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒购自南京建成生物工程公司；兔源双特异性磷酸酶（dual specificity phosphatase，DUSP）6单克隆抗体购自成都正能生物公司；兔源ERK1/2、p-ERK1/2单克隆抗体、Keap1单克隆抗体、核因子红细胞2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）、HO-1单克隆抗体和二抗（HRP-GOAT anti-Rabbit）购自武汉三鹰生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组SH-SY5Y细胞用含10%小牛血清的MEM/F12高糖培养液、37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。将细胞分为空白对照组（PBS平行处理）、模型组（含100μmol/L的H2O2培养基处理细胞4 h）、芒果苷高、中、低剂量组（先用含芒果苷100 nmol/L、50 nmol/L、25 nmol/L的培养基处理4 h后，加入200μmol/L的H2O2培养基处理细胞4 h）。

1.2.2 MTT法检测细胞活力选择对数生长期的SH-SY5Y细胞，胰酶消化，收集细胞悬液以1 000 r/min离心10 min，将浓度为1×106个/mL（100μL）细胞接种于96孔板。培养24 h后，细胞中分别加入不同浓度的芒果苷（6.25、12.5、25、50、100和200μmol/L）和H2O2（0、50、100、200和400μmol/L），每个浓度设置6个复孔。在实验终止前加入10μL MTT（5.0 mg/mL）孵育4 h，每孔加适量DMSO，震摇10 min，酶标仪于490 nm测定处吸光度，计算细胞的活力。

1.2.3 LDH活性的测定收集对数生长期的SH-SY5Y细胞，接种于6孔板中。实验结束后分别收集培养液的上清液，按LDH试剂盒说明书的要求测量各组细胞上清液中LDH活性。

1.2.4 MDA和SOD水平的测定收集对数生长期的SH-SY5Y细胞，接种于6孔板中。实验结束后分别收集各组细胞，制备好细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，沉淀用PBS清洗2次，加入裂解液充分裂解，BCA试剂盒检测蛋白浓度。MDA和SOD检测试剂盒测定细胞内MDA和SOD含量。

1.2.5 Western blot细胞以胰酶消化后加培养液终止消化，加入细胞裂解液低温充分裂解，离心收集上清，以BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入loading buffer煮沸变性。取等量蛋白样品加入10%SDS-PAGE胶，电泳后转膜，5%脱脂牛奶封闭3 h，于一抗中4℃孵育过夜。次日充分洗膜后，二抗孵育2 h，ECL显色，凝胶成像系统显影，并对免疫印迹条带灰度值进行分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 芒果苷对SH-SY5Y细胞活力的影响

MTT法检测结果显示，与空白对照组相比，200 nmol/L芒果苷预孵育4 h后，细胞活力降低（P＜0.05），其余各浓度芒果苷预孵育4 h后的SH-SY5Y细胞活力无显著改变，见图1。

2.2 H2O2对SH-SY5Y细胞造模条件的筛选

MTT法检测结果显示，与空白对照组比较，在H2O2作用下，细胞活力下降呈现剂量依赖性，100、200和400μmol/L H2O2作用后细胞活力显著下降（P＜0.01）。在后续的研究中选择200μmol/L H2O2为造模条件，见图2。

2.3 芒果苷对H2O2损伤SH-SY5Y细胞活力的影响

MTT法检测结果显示，与空白对照组比较，模型组细胞存活率显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，芒果苷高、中、低剂量组（用100 nmol/L、50 nmol/L、25 nmol/L芒果苷治疗）细胞的存活率明显升高（P＜0.05），见图3。

2.4 芒果苷对H2O2损伤SH-SY5Y细胞氧化应激的影响

与空白对照组比较，模型组LDH活性和MDA水平均显著性升高（P＜0.01），SOD水平显著降低（P＜0.01）；芒果苷高、中、低剂量组LDH活性和MDA水平均较模型组显著性降低（P＜0.01），SOD水平显著升高（P＜0.01），见表1。

2.5 芒果苷对H2O2损伤SH-SY5Y细胞DUSP6和ERK表达的影响

Western blot法检测结果显示，与空白对照组相比，模型组中的DUSP6蛋白表达增加，p-ERK1/2蛋白表达减少；与模型组比较，芒果苷高、中、低剂量组DUSP6蛋白表达减少，p-ERK1/2蛋白表达增加，见图4、表2。

2.6 芒果苷对H2O2损伤SH-SY5Y细胞Keap1/Nrf2通路蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，与空白对照组相比，模型组中的Nrf2和HO-1蛋白表达减少，Keap1蛋白表达增多；与模型组比较，芒果苷高、中、低剂量组Nrf2和HO-1蛋白表达增多，Keap1蛋白表达减少，提示芒果苷能 逆 转H2O2损 伤SH-SY5Y细 胞 中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表达，见图5，表3。

图1 不同浓度芒果苷对SH-SY5Y细胞活力的影响

图2 不同浓度H2O2对SH-SY5Y细胞活力的影响

图3 芒果苷对H2O2损伤SH-SY5Y细胞活力的影响

表1 芒果苷对H2O2损伤SH-SY5Y细胞LDH、MDA和SOD的影响（±s）

表1 芒果苷对H2O2损伤SH-SY5Y细胞LDH、MDA和SOD的影响（±s）

注：与空白对照组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01

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3 讨论

PD发病机制不明确，氧化应激学说是目前的研究热点之一。氧化应激是指细胞内的氧化代谢物增加或细胞中氧化保护机制不足时，活性氧物质清除水平降低，导致活性氧在体内增多并引起细胞氧化损伤的病理过程[10]。神经元代谢产生的多胺醌类物质和H2O2及超氧基等细胞毒性物质，在黑质内高浓度铁离子的催化下能产生更剧毒性的羟基损伤细胞，导致了多巴胺神经元细胞更容易产生应激状态。氧化应激在黑质的多巴胺能神经元的变性中发挥着重要的作用[11]。改善氧化应激是保护多巴胺能神经元的重要途径。

芒果苷能抑制坐骨神经氧化应激反应，缓解坐骨神经结扎引起的神经病理性疼痛[12]；以芒果苷给予大鼠灌胃7 d后，脑组织炎症和氧化应激损伤程度降低[13]；这提示芒果苷可能是神经损伤保护剂。

DUSP是一类磷酸酶，能对磷酸化的酪氨酸和丝/苏氨酸去磷酸化，因此被称为双特异性磷酸酶[13]。DUSP参与多种病理过程和各种信号的转导，调节细胞的生长及新陈代谢等[14]。DUSP6是一种MAPK磷酸酶，在MAPK通路中起负性调控作用。Ari等[15]发现睾丸酮代谢物可通过DUSP6依赖的机制抑制SH-SY5Y细胞中氧化应激诱导的ERK磷酸化和神经毒性，表明DUSP6/ERK可降低氧化应激条件下的神经毒性损伤。Nrf2是抗氧化反应的主要调节因子，正常条件下，它与胞浆蛋白伴侣分子Keap1结合使活性处于抑制状态。当细胞受到氧化应激刺激时，Nrf2会从Keap1解耦连并转移到细胞核，与抗氧化反应原件ARE上位点结合，通过上调众多的细胞抗氧化基因来抑制氧化应激的发生[16]。DUSP6/ERK和Keap1/Nrf2是调控氧化应激的关键通路[17]。MDA是脂质的过氧化产物，可以直接反映活性氧对脂质过氧化程度，SOD则直接反映机体清除自由基能力的强弱[18]。

图4 芒果苷对DUSP6、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达的影响

表2 芒果苷对H2O2损伤SH-SY5Y细胞DUSP6和p-ERK蛋白表达的影响(%)

图5 芒果苷对Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表达的影响

表3 芒果苷对H2O2损伤SH-SY5Y细胞Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表达的影响（%,±s）

表3 芒果苷对H2O2损伤SH-SY5Y细胞Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表达的影响（%,±s）

注：与空白对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

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本研究结果表明芒果苷能显著抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤，降低细胞培养基中LDH的释放，降低细胞中MDA的含量，增加SOD活性；初步作用机制是芒果苷能抑制DUSP的表达和ERK的磷酸化程度，同时显著下调Keap1的表达水平，上调Nrf2、HO-1的表达水平。这些结果提示芒果苷对神经细胞的损伤有抑制保护作用，其机制可能是通过调节DUSP/ERK和Keap1/Nrf2通路抑制氧化应激。芒果苷对氧化应激相关的神经退行性疾病可能具有治疗作用，但要得到确切结论尚需进一步研究。