脂联素、IL-32及P-选择素在急性肺损伤大鼠血清及肺组织中的表达

马 莉，刘 宏，荣 芳

（1.山西大同大学医学院，山西大同 037009；2.山西大同大学呼吸病与职业病研究所，山西大同 037009）

急性肺损伤是一种临床上常见的危重病症，死因多为急性呼吸窘迫综合征和多脏器功能障碍综合征[1]。近年研究发现，白介素-32(Interleukin-32,IL-32)可促进IL-6、IL-8、和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等表达[2-3]；P-选择素主要介导白细胞与内皮细胞的黏附，参与炎症反应、启动及扩大血栓形成[4]；脂联素可能对许多疾病有保护作用[5]。目前这3 种细胞因子对急性肺损伤的作用尚不清楚。本课题以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导大鼠急性肺损伤模型，观察脂联素、IL-32和P-选择素在急性肺损伤大鼠血清及肺组织中的表达，分析三者在大鼠急性肺损伤中的变化规律，以探讨急性肺损伤的发病机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性Wistar大鼠40只，体质量200±20 g，购于山西医科大学实验动物中心。动物随机分为生理盐水对照组(NS组)(n=20)和LPS急性肺损伤组(LPS组)(n=20)。每组分为4批(2 h、6 h、24 h和72 h)，每批5只大鼠。LPS组腹腔内注射LPS(8 mg/kg)制备急性肺损伤模型，对照组腹腔注射等量生理盐水。注射后2 h、6 h、24 h和72 h，分别处死动物。

1.2 观察指标

LPS组和NS组大鼠分别于LPS腹腔注药后2 h、6 h、24 h、72 h 去眼球取血，分离血清置于冰箱-70 ℃保存备用，检测相应的ELISA试剂盒(上海抚生实业有限公司)检测脂联素、IL-32及P-选择素水平。

取右肺前叶组织放入冻存管中，液氮中保存待检。将冷冻肺组织与液氮一起碾磨，放入组织匀浆器，加入细胞裂解液，提取蛋白。最后采用Western blot法检测肺组织中脂联素、IL-32和P-选择素蛋白含量。方法如下：提取各组肺组织总蛋白，用BCA 法测定蛋白浓度后，取30 μg 蛋白样品上样于聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜；脱脂奶粉室温封闭2 h，加入相应一抗4 ℃(美国Sigma 公司)孵育过夜，以β-actin 为内参照。用TBST 洗膜后，加二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)室温孵育1 h，ECL 显色。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示。组间比较采用重复测量的方差分析，使用LSD法进行检验后多重比较。P＜0.05时有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS对大鼠血清中脂联素、IL-32及P-选择素表达的影响

2 组患者在注射后2 h、6 h、24 h 和72 h 进行血清脂联素、IL-32 和P-选择素比较，采用重复测量数据的方差分析，结果：①2 组比较不同时间点血清脂联素、IL-32和P-选择素有统计学差异；②NS组大鼠血清脂联素、IL-32和P-选择素不同时间点变化无差别(F=4.258,P=0.087；F=3.906,P=0.102；F=6.765,P=0.063)；③LPS 组血清脂联素、IL-32 和P-选择素变化趋势有统计学差异(F=21.147,P=0.001；F=18.476,P=0.010；F=26.961,P＜0.001)，见表1～3。

表1 2组大鼠血清中脂联素定量分析 /pg·mL-1

表2 2组大鼠血清中IL-32定量分析 /pg·mL-1

表3 2组大鼠血清中P-选择素定量分析 /pg·mL-1

2.2 Western blot分析

2组大鼠在注射后2 h、6 h、24 h和72 h进行肺组织中脂联素、IL-32 和P-选择素比较，采用重复测量数据的方差分析，结果：①2 组之间不同时间点血清脂联素、IL-32 和P-选择素有统计学差异；②NS 组血清脂联素、IL-32 和P-选择素不同时间点变化无差别(F=5.093,P=0.079；F=4.361,P=0.094；F=7.418,P=0.053)；③LPS 组血清脂联素、IL-32 和P-选择素变化趋势有统计学差异(F=22.937,P＜0.001；F=16.728,P=0.017；F=28.092,P＜0.001)，见表4～6。

表4 2组大鼠肺组织中脂联素定量分析 /pg·mL-1

表5 2组大鼠肺组织中IL-32定量分析 /pg·mL-1

表6 2组大鼠肺组织中P-选择素定量分析 /pg·mL-1

3 讨论

急性肺损伤是由多种病因引起的急性呼吸衰竭，是临床各科常见危重病症。其中呼吸窘迫综合征是急性肺损伤的严重阶段，死亡率很高，其发病机理尚不完全清楚。本研究通过在大鼠腹腔注射LPS 制备肺损伤模型，大鼠在注射LPS 2 h 后出现蜷缩少动，反应迟钝，呼吸明显加快，而注射NS的大鼠状态无明显变化。

研究结果显示，不管是血清还是肺组织，LPS组大鼠注射后2、6、24和72 h脂联素含量均明显低于NS 组；而LPS 组大鼠注射后2、6、24和72 h IL-32和P-选择素含量均明显高于NS 组。而且在24 h时2 组之间差异最大，在72 h 时差异减少，提示大鼠在注射LPS 24 h时肺组织损伤最严重。脂联素是由脂肪细胞分泌的一种蛋白质，最近研究发现其具有抗炎和保护血管的作用[6]。此外，动物实验表明，脂联素对于维持肺的免疫稳态具有重要的作用[7]。因而脂联素具有保护内皮细胞及抗炎抗氧化等作用，而急性肺损伤大鼠中脂联素降低，提示其保护作用减弱。IL-32 是一种编码炎症性细胞因子，可通过激活NF-κB、p38 丝裂原活化蛋白激酶磷酸化和caspase-1 依赖途径诱导IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-2、TNF-α等细胞因子和趋化因子产生，参与炎症反应过程[2]。Arcaroli 等人研究发现，IL-32 参与急性肺损伤的炎症反应，其水平与肺组织的损伤严重程度密切相关[8]。本研究中，大鼠急性肺损伤后IL-32 浓度持续增高，可能参与炎症反应。P-选择素是血小板活化的灵敏标记物，与免疫损伤、炎症反应和血栓的形成密切相关[9]。有研究报道，急性肺损伤E-选择素浓度显著增高，肺组织中P-选择素表达增加[10]。这与本研究结果是一致的。

本研究表明，IL-32和P-选择素可能参与肺组织损伤，脂联素的保护作用减弱。但是本实验仅对脂联素、IL-32 和P-选择素进行了检测，其调控机制不明确，以后实验中需要进一步对其调控途径机制进行研究。