无菌马尾松种子超低温保存技术研究

张晓宁 黄宁 覃子海 姚瑞玲 杨红 刘海龙

摘 要：該研究利用液氮将不同含水量的无菌马尾松种子（27.4%、24.6%、22.7%、16.8%、15.8%、10.7%、7.5%、6.1%、4.8%、3.2%）进行超低温保存。结果表明：（1）在3.2%～6.1%含水量范围内，经液氮冷冻保存后的发芽率随着含水量升高而逐渐升高，在含水量6.1%时，发芽率达到最大值（91.33%）;当含水量大于6.1%时，发芽率逐渐下降，尤其是当含水量大于15.8%时，发芽率迅速下降;在3.2%～7.5%含水量范围内冻存后发芽率在80%以上。（2）冷冻、化冻方式影响超低温保存效果。种子无需低温预冷，直接投入液氮保存（快速冷冻）效果最好;室温空气化冻（缓慢化冻）较42 ℃水浴化冻发芽率高，且后者容易发生种皮炸裂现象。（3）种皮对马尾松种子超低温保存过程起到保护作用，使其免受机械损伤，去掉外种皮的种子冻存后发芽率显著下降，且容易出现形态不正常的幼苗。（4）超低温保存对马尾松种子萌发具有一定“刺激”作用，在最适含水量6.1%时，经超低温保存后种子的发芽率显著大于对照种子。总之，含水量、冷冻方法、化冻方法、种皮结构显著影响超低温保存效果，马尾松种子超低温保存的最优方法是将种子含水量控制在6.1%，直接投入液氮快速冷冻后室温空气缓慢化冻，冻后发芽率可在90%以上。马尾松种子超低温保存技术体系的建立，为其种质资源的长期保存提供了技术支持。

关键词：马尾松种子，超低温保存，干燥，含水量，安全含水量范围，发芽率

中图分类号：Q945

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2020）07-0935-09

Abstract：To explore long term preservation of Pinus massoniana seeds through cryopreservation technology，aseptic seeds of P. massoniana with different water contents （WC） （27.4%，24.6%，22.7%，16.8%，15.8%，10.7%，7.5%，6.1%，4.8%，3.2%） were cryopreserved in liquid nitrogen. Our results showed that：（1） The germination of cryopreserved seeds increased when the seed WC elevated from 3.2% to 6.1%，reaching the highest rate of 91.33% at the optimum WC of 6.1%; However，seed germination decreased as WC further increased from 6.1% to 27.4%，in particular， with a rapid decline in germination of seeds with 15.8% or higher WC; There is a wide range of safe WC，within 3.2%-7.5%，the average germination rate reached above 80%. （2） In addition to WC，freezing and thawing methods also affected cryopreservation. Rapid freezing by directly immersing seeds into liquid nitrogen is better than pre-freezing at -20 ℃ prior to liquid nitrogen freezing; a slow air-thawing at room temperature gave a better germination result compared with a rapid thawing in a 42 ℃ water bath that caused seed episperm cracking. （3） The episperm also played an important role，which protected the seeds from the mechanical damage. The germination rates without episperm were significantly lower than those with episperm，and the abnormal seedlings were more observed when the episperms were removing. （4） At the optimum WC of 6.1%，cryopreserved seeds germinated better than those non-cryopreserved （control），indicating that cryopreservation may stimulate seed germination of P. massoniana. Collectively，our results showed that water content，freezing and thawing methods as well as the episperm structure can significantly affect cryopreservation of P. massoniana seeds; and the best method for cryopreservation of P. massoniana seeds is to directly freeze seeds with 6.1% WC using liquid nitrogen followed by a slow air-thawing at room temperature，by which the germination can reach above 90%. Results from this study may provide a rational for a long-term storage of P. massoniana seeds through cryopreservation.

Key words：Pinus massoniana seeds，cryopreservation，desiccation，water content，range of safe water content，germination percentage

馬尾松（Pinus massoniana）为松科松属常绿高大乔木，是我国分布最广的优质乡土针叶及南方主要造林、绿化树种，广泛应用于用材、产脂、荒山造林及制浆造纸，在森林资源建设及生态发展中发挥着极其重要的作用（秦国峰和周志春，2012;杨章旗，2012）。广泛的地理分布和悠久的进化起源赋予马尾松种质资源丰富的遗传多样性，由于自然环境恶化及人为破坏等因素，所以其天然林在演替过程中逐渐被常绿阔叶林和人工林替代，加上单一人工林在应对病虫害及恶劣环境等自然灾害方面存在的局限性，其种质资源多样性正受到严重威胁（石娟等，2005;邓伦秀和李茂，2009）。因此，开展对马尾松种质资源保存的研究就显得尤为迫切和必要。种子作为植物生命的载体，蕴含着丰富的遗传信息，是遗传改良、品种创新和良种生产的重要物质基础。种子的离体保存能在有限的空间最大限度地保存材料的遗传多样性，且不受病虫害及天气等影响，具有成本低、效率高、交流、运输方便等优点，是目前马尾松种质资源保存最主要的方式之一。

秦国峰等（2017a）研究表明马尾松种子随着保存期限的延长，其品质不断下降，常温开放保存3～4 a几乎全部丧失发芽力，在2～4 ℃低温密闭保存可在10 a以上。虽然低温密闭条件延长了马尾松种子的保存期限，但相比其漫长的生命周期和从发芽到产生可用于繁殖下一代种子的时间间隔仍显短暂，从保障种质资源安全的角度来看，延长其保存期限具有重要意义，而超低温保存正是目前为止实现种质资源长期保存的最佳途径。

种子的超低温保存是指将种子投入到液态氮（-196 ℃）或气态氮（-150 ℃）条件下进行保存。在此温度下，大多数植物的种子新陈代谢活动基本停止，劣变最大限度降低，理论上可以保存成百上千年（Walters et al.，2004;Basu，2008），是目前一种集简便、实用、占地少、低成本于一体的长期保存种质资源的方法（Wilde，2015）。超低温保存技术已成功应用于多种木本植物成熟种子或种胚的保存，如樱桃（宋常美等，2019）、樟树（马健等，2019）、黑杨（Marcin et al.，2015）、合欢和青杄（河英虎等，2013）、高山栲（卢玲等，2013）、红豆杉（程利红等，2012）。

孙鸿有等（1994）的研究认为，马尾松种子最适保存温度是-18～-15 ℃。

喻方圆等（2006a）研究认为，种子在-30 ℃储藏初期发芽率就开始大幅下降。谭俊（2009）研究认为，从种子的安全贮藏来看，马尾松种子不适合在-25 ℃及以下的温度贮藏。喻方圆等（2006b）利用差式扫描量热仪证明，马尾松种子在-24.826 ℃的温度下结晶，细胞质中粗脂肪含量高，低聚糖与蔗糖比值低，决定了其难形成玻璃化状态，并推测这是马尾松种子不耐-30 ℃以下储藏的主要原因。

杨学军（2008）首次利用脱水干燥法将马尾松种子进行了超低温保存，当含水量为4.3%时，获得80%的发芽率，但主要针对含水量和冷冻保护剂对超低温保存效果的影响进行了研究。本研究在此基础上，以无菌种子为材料，系统研究了含水量、冷冻方式、化冻方式及种皮的保护作用等对冻存效果的影响，简化了马尾松种子超低温保存技术体系，提高了保存效率，确定了最适含水量和安全含水范围，并首次指出超低温保存对马尾松种子具有一定“刺激”作用，进一步验证马尾松种子超低温保存的可行性。这对马尾松种子资源长期保存提供了理论指导和技术支撑，为其他林木种子的超低温保存研究提供参考。本研究利用无菌种子不仅消除了种子发霉对发芽率的干扰和影响，而且还可直接获得无菌幼苗用于后续研究。

1 材料与方法

1.1 种子质量特性的测定及含水梯度的建立

试验用马尾松种子于2017年11月采自广西藤县。试验用干燥箱：上海施都凯，BAO-150A;超净工作台：苏州净化SW-CJ-2D;光照培养箱：杭州汇尔GZH-0158;冷冻管：美国 Nunc;硅胶：上海新火;KMnO4 ：郑州中天实验仪器有限公司;升汞：贵州省铜仁化工研究所。

参照《林木种子检验规程》（国家质量技术监督局，2000）要求测定千粒重、初始含水量和发芽率等种子质量特性。

1.1.1 发芽率的测定 将待测种子播种于含双层滤纸的培养皿，定期喷水，保持滤纸湿润。光照培养箱27 ℃黑暗培养5 d; 第6天开始，光照强度2 000 lx，光照时间8 h·d-1。当根长等于种子长时记为发芽。发芽率=（发芽种子数/种子总数）×100%。4个重复，每重复100粒。

1.1.2 初始含水量（ω0）的测定 采用低温烘干法（103 ℃烘干16 h）测定，ω0=（鲜重-绝干重）/鲜重×100%。3个重复，每重复50 g。

1.1.3 含水梯度的获取 消毒后的种子采用浸种和硅胶干燥的方式获取27.43%～3.2%的10个含水量梯度的种子，密闭于双层铝箔袋中4 ℃保存备用。实际含水量（ω1）采用减重法计算，ω1=100%-[最初重量×（100%-相对含水量）]/最后重量。（消毒方式：流水冲洗2 h，0.5% KMNO4浸泡0.5 h，无菌水冲洗6次，0.1%升汞消毒5 min，无菌水冲洗6次。）

1.2 种子的超低温保存试验

1.2.1 不同含水量对冻存后发芽率的影响 先取含水量分别为3.2%、4.8%、6.1%、7.5%、10.7%、15.8%、16.8%、22.7%、24.6%、27.4%的马尾松种子装于1.8 mL冷冻管中直接投入液氮保存24 h后，室温自然化冻，随后将种子播于铺有三层无菌滤纸的培养皿中，封口，置于光照培养箱进行发芽试验，并测定冻存后发芽率。

1.2.2 冷冻方式对冻存后发芽率的影响 取含水量为3.2%、4.8%、6.1%、10.7%、16.8%、22.7%、27.4%的 7个梯度的种子装于冷冻管中进行如下操作：（1）快冻法：直接投入液氮;（2）缓冻法：经-20 ℃预冻30 min投入液氮;（3）慢冻法：经-20 ℃低温预处理24 h后投入液氮。三种冷冻方式统一在液氮保存24 h后，室温自然化冻，统计发芽率。

1.2.3 化冻方式对冻存后发芽率的影响 先将上述7个含水量梯度的种子直接投入液氮，冻存后的材料从液氮中取出，设置室温空气化冻、42 ℃水浴化冻两种化冻方式各5 min后，再将种子播于铺有三层无菌滤纸的培养皿，封口，置于光照培养箱黑暗培养，记录冻存后发芽率。

1.2.4种皮对冻存后发芽率的影响 取含水量为27.4%、10.7%、6.1% 和3.2%的种子，剥去种皮，装于1.8 mL冷冻管，直接投入液氮保存24 h，室温空气化冻后，测定发芽率。

1.2.5超低温保存对种子发芽率的影响 取含水量为27.4%、10.7%、6.1%和3.2%的种子装于1.8 mL冷冻管中直接投入液氮保存24 h，室温空气化冻后置于含三层湿润滤纸的培养皿测定冻存后发芽率;对照不经液氮直接放入相同条件培养皿测定发芽率。

1.3 数据分析

试验设置3个重复，每个重复100粒种子。采用Microsoft Office Excel（2016）软件对数据进行统计分析和绘图。试验结果为3个重复的平均值±标准误。数据差异的显著性采用SPSS方差分析中的 Duncan 新复极差法进行估算。

2 结果与分析

2.1 种子的质量特性及含水量梯度的建立

待测马尾松种子千粒重为11.48 g，含水量为9.56%，发芽率为90.25%。利用浸种和硅胶干燥的方式获取含水量为27.4%、 24.6%、22.7%、16.8%、15.8%、10.7%、7.5%、6.1%、4.8%、3.2%等10个梯度的种子，用以进行超低温保存等后续研究。

2.2 不同含水量对超低温保存后种子发芽率的影响

10个不同含水量梯度的马尾松种子冻存后发芽率结果如图1所示。随着含水量的下降，冻存后发芽率逐渐增高，直到含水量降为6.1%时，发芽率达到最大值91.33%，当继续干燥，发芽率不再上升，甚至有轻微的下降，6.1%为马尾松种子超低温保存的最适含水量。含水量为6.1%～15.8%时，发芽率缓慢下降;当含水量大于15.8%时，发芽率急剧下降。含水量从15.8%增加到16.8%时，发芽率从69.33%迅速下降到45.67%。马尾松种子适宜超低温保存的含水量范围很广，将冻后发芽率在80%以上的含水量范围3.2%～7.5%作为马尾松种子超低温保存的安全含水量范围。

2.3 不同冷冻方式对超低温保存后种子发芽率的影响

不同冷冻方式对超低温保存效果的影响如图2所示。不同含水量的种子利用缓冻和慢冻法进行超低温保存后发芽率均不同程度地低于快冻法保存，结果表明将马尾松种子直接投入液氮保存效果优于先在-20 ℃预冻不同时间再投入液氮。

2.4 不同化冻方式对马尾松种子超低温保存后发芽率的影响

室温空气化冻和42 ℃水浴化凍对马尾松种子超低温保存效果的影响如图3所示。图3结果显示，室温空气化冻效果优于 42 ℃水浴化冻，含水量越小，两种化冻方式的差异越明显，采用室温空气化冻后不需要回湿直接置于含湿润滤纸的培养皿进行发芽试验。另外，研究发现42 ℃水浴化冻会发生种子炸裂现象，致使种子受到机械损伤。

2.5 外种皮对超低温保存效果的影响

外种皮对超低温保存效果的影响如图4所示，在4个含水量梯度下，带外种皮的种子保存后发芽率显著高于去掉外种皮的种子，但去掉外种皮种子冻存后露白时间要早于带外种皮的种子1～2 d，可能是解除了种皮的机械限制作用的结果。

保留外种皮的种子胚根先突破胚乳和种皮长出，接着下胚轴延伸，当下胚轴伸长到一定程度后，子叶初现如图5：A，B所示，去掉外种皮的种子发芽情况如图5：C-G所示。其中：图5：C，D所示为正常发育的种子，胚根先突破胚乳长出（图5：C），后下胚轴延长、子叶初现（图5：D）;图5：E-G为发育顺序或幼苗形态异常的情况，子叶和下胚轴同时在种子两端生长（图5：E），子叶和下胚轴在胚根发育相反一侧先于胚根发育（图5：F），子叶和下胚轴在种子中间突破胚乳发育延长（图5：G）。这种发育顺序异常或者说幼苗形态异常现象的具体原因及机理机制有待于深入研究。

2.6 超低温保存对种子发芽率的影响

含水量为3.2%、6.1%、10.7%、27.4%的马尾松种子经超低温保存前后发芽率如图6所示，当含水量为6.1%时，经超低温保存后发芽率为91%，显著高于该含水量下不经超低温保存的马尾松种子的发芽率86%，P=0.049（P<0.05）。这表明在最适含水量6.1%时，超低温保存后对种子的发芽表现出了适度的“刺激”作用。

3 讨论与结论

据报道，林木种子离体保存资金投入约是其树上原位保存的1%（Li & Pritchard，2009），而作为离体保存方法之一的超低温保存，能在较小的空间较低的成本下极大地延长材料的保存时间（Trajkovic' et al.，2019）。借助超低温保存技术，正常型林木种子的保存寿命有望延长到百年及以上（Wang & Simpson，2006）。毫无疑问，超低温保存是目前为止最经济有效的长期保存种子资源的方法。种子的超低温保存一般是将种子投入液氮一定时间（几小时至几年）取出化冻后采用TTC染色法监测材料的生活力或直接监测发芽率判断该方法的适用性。马尾松种子在液氮保存24 h后化冻后发芽率为91.33%，本研究不仅为马尾松种子的长期保存提供了高效可行的方法，而且还为马尾松种质资源超低温库的建设提供了理论依据和实践指导，并为其他林木种子超低温保存研究提供了借鉴。

植物的超低温耐性与其脱水耐性、过冷却能力和玻璃化能力密切相关（文彬，2011;Popova et al.，2012）。根据脱水耐性及储藏能力种子被分为正常型、中间型、顽拗型三种类型。一般将能忍受脱水至含水量为0.05 g·g-1DW并能在0 ℃以下低温保存的称为正常型种子，林木正常型种子成熟或脱落时含水量一般为20%～50%（Wang & Simpson，2006）。据此可明确马尾松种子为正常型种子。正常型种子因为耐脱水，可以在冷冻前把自由水安全地移除，因此存在一个相对较宽的安全含水量范围。对于这类种子FAO/IPGRI推荐的适合长期保存的含水量为4%～7%，本研究的结果与此相近。在3.2%～7.5%时，发芽率较高（在80%以上），因此认为3.2%～7.5%为马尾松种子的安全含水量范围，在这个范围内既可以避免高含水量在零下低温时造成的胞内结冰损伤又可以避免含水量过低引起的脱水损伤。本研究中，当含水量从6.1%升到15.8%时，发芽率缓慢下降（从91.33%降到69.33%），含水量大于15.8%时，发芽率急剧下降，但直到含水量升为22.7%时，发芽率仍高达34%。这与杨学军（2008）的研究结果有些不同，虽然他指出当含水量超过15.6%时，马尾松种子超低温保存后发芽率急剧下降，但其结果显示当含水率大于21.6%时，发芽率仅为2%。一般认为含水量是影响超低温保存效果的主要因素之一。史锋厚等（2005）研究认为含水量对超低温保存效果的影响不显著，其原因可能是试验油松种子本身的含水量较低，已经在超低温贮藏的适宜含水量范围之内，加上其实验设计的含水量梯度不大。本研究中，马尾松种子初始含水量为9.56%，并通过干燥和浸种扩大其含水量梯度为3.2%～27.4%，结果证明虽然马尾松种子超低温保存安全含水量范围较广，但含水量仍然对影响超低温保存效果有显著影响。

胞内结冰是影响超低温保存成功与否的关键因素之一。玻璃化状态的形成理论上可以避免细胞内冰晶的形成（曾琳等，2014）。细胞内含物如可溶性糖、可溶性蛋白能提高植物的脱水耐性，降低过冷却点，增强玻璃化能力（文彬，2011）。如喻方圆等（2006b）研究认为脂类对杉木种胚玻璃化状态的形成十分重要。顽拗性种子易受超低温伤害的主要原因是细胞代谢旺盛，线粒体、内膜系统丰富，液胞大而脂肪体，蛋白体和淀粉粒少（文彬，2011）。相反，Vertucci（1989）研究认为富含油脂的正常型种子易受超低温伤害：一方面是贮油体与水分的相互作用会促进大冰晶的形成，导致电解质的泄露;另一方面是这类种子在冻存过程中容易因油体破裂导致生活力丧失。马尾松种子富含油脂，其粗脂肪、粗蛋白质和总糖含量分别为44.8%、42.5%、7.1%（秦国峰等，2017b），但未发现油脂对其超低温保存的不利影响，相反，在最适含水量6.1%时，经超低温保存后马尾松种子的发芽率较对照有所上升。这种超低温保存对种子发芽的“刺激”作用，在人参（商丽煌等，2018）和一些野生花卉也有报道（王荷和刘燕，2011）。马尾松种子内含物成分及含量与其耐受超低温保存的关系，以及超低温保存对其发芽率的“刺激”作用的机理机制有待于进一步研究。

超低温保存对材料的伤害是一个累积的过程，冷冻阶段的结冰和化冻阶段的次生结冰都会导致机械损伤。因此，一般采取快速冷冻（曾琳等，2018）、快速化冻（Zhang et al.，2014）使材料迅速通過冰晶生长的温度危险区。有研究认为大块材料的快速升温可能因为受热不均匀发生机械伤害。本研究在含水量高的情况下，发现从液氮取出后，种子冻结成一整块儿，推测这可能是高含水量种子发芽率低的原因之一。本研究采用直接投入液氮的快速冷冻和室温空气缓慢化冻的方法保存效果最好，42 ℃水浴快速化冻发芽率较低，同时观察到种子炸裂现象。此现象在合欢、祁州漏芦等种子（王荷和刘燕，2011;何英虎等，2013）的研究中有报道，认为这种炸裂与种子含水量有关系，随着含水量的降低，发生炸裂的种子比例增加。主要原因可能是种子承受不了冷冻和化冻过程中的巨大物理压力而导致（何英虎等，2013）。这种炸裂对种胚产生的机械损伤可能是其低发芽率的原因之一。种壳能极大地提高种子在冷冻和化冻过程中所承受的物理压力，减缓温度变化对种皮的直接伤害而对种子起到保护作用，如在红水樱桃种子超低温保存研究中，无种壳种子污染率高，发芽率低，且苗畸形（宋常美等，2019）。本研究认为种皮或种壳在超低温保存中起到一定保护作用，去掉种皮的种子冻存后发芽率有所下降，且由于没有种皮的保护，胚根和子叶的发育受到了影响，所以出现了形态不正常的幼苗。本研究通过降低化冻温度，缓和化冻时种子内部发生的热量交换有效地缓解了种子炸裂的问题。

总之，超低温保存是目前为止种子资源长期保存最有效的方法。种子的超低温耐性与其脱水耐性、过冷却能力和玻璃化能力密切相关，而这些能力又受到种子特性（如大小、顽拗性程度、含水量、种皮结构、内含物组分）以及冷冻、化冻方式、冷冻保护剂作用、冻后的复水、回湿、吸涨吸水及恢复培养等各种因素影响。本研究证实了含水量、冷冻方式、化冻方式及种皮的保护作用等对马尾松种子冻存效果的影响，确定了最适含水量和安全含水范围，初步建立了马尾松种子超低温保存技术体系，获得了高发芽率的长期保存方法，但其超低温保存保护和损伤的机理机制仍不明确，需要进一步从生理生化和蛋白组学等方面开展研究。

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（责任编辑 蒋巧媛）