廊坊地区MTHFR C677T基因多态性和孕期不同阶段血清HCY水平的相关性研究

邢焕霞 付敏 郑胜侠 杨琦 韩玉成

随着人类基因组学、蛋白质组学和代谢组学研究的深入，现已证实叶酸代谢相关的孕期、围产期合并症如胎盘早剥、妊娠高血压综合征、早产、流产等的发生和出生缺陷如神经管缺陷、非综合征性唇腭裂、先天性心脏病、唐氏综合症等并不是和叶酸缺乏直接相关，而是和血浆中同型半胱氨酸(HCY)不能正常代谢，在血浆中过量蓄积有密切联系[1-5]。有研究显示高HCY 水平刺激血管平滑肌细胞增生，使血管内皮损伤和功能异常，破坏机体凝血和纤溶系统，进而引起妊娠期合并症一系列症状产生[6]。文献报道有关流行病学显示有过唐氏综合症、神经管畸形和先天性心脏病等病史的母亲，以及复发性流产和妊娠高血压综合征的孕妇体内HCY 水平较高[7,8]。国内外研究中证实在动物模型试验中高HCY 血症能激发胚胎细胞过度凋亡，抑制胚胎细胞合成遗传物质DNA 和RNA，细胞内长期HCY高水平可造成染色体不分离等，导致胎儿生长发育畸形，严重者引起早期胚胎死亡[9,10]。20世纪 90年代初，研究发现生育过神经管缺陷(NTDs)的孕妇HCY 水平明显高于对照组,随后越来越多的研究证明 HCY代谢异常在 NTDs、妊娠高血压等疾病的发生上扮演着重要角色。西方学者将HCY称为“邪恶氨基酸”，它是一种含硫氨基酸，属于蛋氨酸和半胱氨酸代谢循环中的中间代谢产物,HCY 代谢主要有两条途径，若与这两条途径相关的酶或因子的基因突变，可引起 HCY水平升高，HCY水平升高后将产生大量自由基和过氧化氢，从而损伤了血管内皮细胞结构和功能，因此成为NTDs、妊娠高血压等疾病发生的高危风险因素。HCY水平还受遗传因素、膳食营养因素、疾病、年龄等因素影响[11]，乔福元等[11]研究指出孕早期HCY水平可作为妊娠高血压预测指标之一，孕中期HCY水平可作为诊断早期妊娠高血压的重要指标。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是Hcy代谢关键酶，突变的677碱基C/T使基因频率多态化，从而使酶活性下降，可引起Hcy的蓄积。本文拟通过检测孕期不同阶段HCY水平和MTHFR基因频率，分析孕期不同阶段及产后42 d HCY变化与遗传因素的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院产前诊断中心2016年5月至2019年6月进行孕期检查的汉族女性，入组人群系廊坊地区居民，排除标准：(1)籍贯非本省本地区者；(2)患有甲状腺疾病、冠心病、恶性肿瘤、糖尿病、免疫系统或血液系统疾病者；(3)肝肾功能不全者、曾行肠胃切除手术或患严重消化系统疾病者。入组对象922例汉族女性，平均年龄(25.46±3.52)岁。

1.2 方法 利用中国疾病预防控制中心妇幼保健中心指定的采样拭采集的受检者口腔黏膜细胞，提取受检者DNA样本使用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒。采用 Taqman-MGB 技 术 对MTHFR 基因 C677T、A1298C位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型进行检测。探针序列如下：MTHFR A1298C：5’-AAGAACGAAGACTTCAAAGACACTT[G/T] CTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCA-3’；MTHFR C677T:3’-GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG[G/A]CTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAA-3’。在每个10 μl反应体系中包含：2 x Taqman Universal MasterMix 5 μl， 20 ng/μl DNA模板 1 μl，去离子水 3.5 μl，20 x Taqman-MGB探针0.5 μl。反应条件设置：95℃下反应10 min，92℃下反应15 s，60℃ 下反应1 min扩增20个循环，89℃下反应15 s，60℃下反应90 s 扩增30个循环。反应结束后，利用ABI 7500型的荧光定量PCR检测仪读取终点荧光，利用相关分析软件分析并确定搜集样本的基因型结果。研究中的相关仪器、试剂购于美国ABI公司。在孕期第10～14周、第24～28周、第32～36周和产后42 d采集孕早期、孕中期和孕晚期入组对象的血样，使用仪器为贝克曼公司全自动生化免疫分析仪AU680，采用酶法检测血清HCY浓度，试剂购自艾威德(北京)医疗科技有限公司。

2 结果

2.1 基因型及等位基因与其他地区汉族女性比较 选取已报道的地区级地区人群数据，与本地区人群MTHFR基因遗传多态性频率分布情况进行比较。廊坊地区的汉族女性MTHFR 677TT基因型频率为33.5%，显著低于淄博等地人群(P<0.05)，与尚志、长春等地数据差异无统计学意义(P>0.05)。MTHFR 1298CC基因型频率为2.0%，与尚志、乌鲁木齐、长春等地数据差异无统计学意义(P>0.05)，但与眉山、长沙等地数据比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

表1 不同地区汉族女性 MTHFR 基因型频数和频率比较[12-21] 例(%)

表2 不同地区汉族女性MTHFR等位基因频数和频率分布比较 例(%)

2.2 基因位点连锁情况分析 最常见的组合是CT/AA (33.2%),TT/AA (33.3%)，少见的组合是TT/AC(0.2%)，未发现TT/CC和CT/CC组合。从组合中可以看出，MTHFR其中一个位点突变时，另一个位点突变的概率会降低。见表3。

表3 MTHFR C677T和A1298C连锁型分布 例(%)

2.3 不同基因型对应的孕期不同阶段HCY水平分析 MTHFR C677T位点三种基因型HCY水平均值依次为 CC组3.84 μmol/L，CT组3.85 μmol/L，TT组3.85 μmol/L，经单因素方差分析组间差异无统计学意义(P>0.05)。孕期不同阶段HCY水平组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 不同基因型对应的孕期血清HCY浓度比较

2.4 不同基因型对应的产后42 d HCY水平 从入组人群中选取192位前来我院做产后42 d检查女性，比较该组人群孕期和产后42 d HCY水平，结果表明产后42 d组HCY水平显著高于孕期(P<0.05)，MTHFR C677T三种基因型对产后42 d HCY水平比较，TT型较CC型和CT型差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 不同基因型对应的产后42 d血清HCY浓度比较

3 讨论

本研究对廊坊地区孕期女性MTHFR C677T基因频率研究，得到CC型、CT型、TT型的频率分别为16.8%、49.7%、33.5%，与2014年报道本地区TT基因频率无显著性差异[22]。本研究进一步发现 MTHFR C677T 基因频率与孕期不同阶段HCY水平无显著性差异，与产后42 d高HCY水平存在关联，MTHFR C677T TT型较CC型和CT型HCY水平有显著升高，这一研究结论与劳海红等[23]研究结论不一致。多项研究中证实MTHFR C677T基因频率多态性具有地域、种族差异性[24]。复旦大学方绮雯等[25]研究测定了上海地区1 000例孕妇的MTHFR C677T基因多态性与HCY水平，结果中显示携带T等位基因孕妇是高同型半胱氨酸血症的危险因素。本研究对孕期不同阶段同型半胱氨酸值做了测定，缺乏孕前期数据， HCY变化还需要检测孕前数据，以便更准确分析整个孕期HCY数值变化情况。

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)，它在第一号染色体1p36.3上，全长20.374 kb。MTHFR是Hcy循环中叶酸代谢关键酶，外源性叶酸经人体吸收转化为四氢叶酸，经MTHFR催化下形成有活性的N5-四氢叶酸，继续在甲硫氨酸合成酶(MS)催化叶酸、维生素B12辅酶作用下使HCY甲基化代谢为甲硫氨酸。甲硫氨酸在ATP作用下转化为S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。而SAM可在体内生化反应中提供甲基用于蛋白质及DNA的甲基化。

叶酸是同型半光氨酸代谢途径中的必须因子，缺乏或代谢异常可导致DNA合成或半胱氨酸代谢途径受阻，蓄积导致高半胱氨酸血症。

MTHFR 677碱基C/T基因频率多态化，使酶活性下降，导致同型半光氨酸代谢途径中断，血液循环中同型半胱氨酸蓄积浓度升高，引起连锁生物反应。研究表明同型半胱氨酸蓄积，人体内生化反应甲基化不足，造成染色体分离不全，引起多种胎儿畸形及后续重要生物活性物质合成障碍；高同型半胱氨酸水平给胚胎神经系统造成不可逆损害，导致神经管缺陷(NTDs)如无脑、脊柱裂等损害；高同型半胱氨酸水平导致血管内皮细胞功能障碍、血管壁弹性下降及附壁粥样斑块钙化明显，导致心脑血管疾患风险增加。

HCY是一种含硫氨基酸，它的生物学效应具有多样性，与多种疾病发生相关。同型半胱氨酸是多种妊娠并发症的早期诊断、治疗依据之一，如GDM(妊娠糖尿病)、妊娠高血压综合征、胎儿生长受限、低体重儿、出生缺陷如神经管缺陷、唐氏综合征等。高同型半胱氨酸与多囊卵巢综合征(PCOS)患者高雄激素及胰岛素抵抗有密切关联，亦会影响卵子质量及发育潜能，导致种植率降低、流产率升高[26]。国内外研究对孕期同型半胱氨酸水平变化与低出生体重、早产、妊娠期高血压文献较多，郭燕华等[27]观察18周内孕妇血清HCY水平等因素对产后胎儿体重、早产结局的影响，结果显示血清HCY水平越高，新生儿体重偏轻的风险越高，早产和子痫前期发生率也越高。黄华等[28]研究表明孕中期及孕晚期孕妇血清HCY水平升高，其妊娠期高血压疾病发生风险明显增加，可将血清HCY水平作为评价和预测妊娠期高血压疾病的可信指标。

综上，本研究发现廊坊地区MTHFR C677T基因频率多态性变化对孕期血清同型半胱氨酸水平无显著性影响，TT型对产后42 d血清同型半胱氨酸水平有显著性影响。同时多项研究支持高同型半胱氨酸血症是多种疾病的独立危险因素[29]，所以针对不同地区、不同民族、不同孕期阶段展开大规模MTHFR C677T基因频率多态性、血清同型半胱氨酸水平及多种疾患相关性研究非常必要，可进一步降低同型半胱氨酸相关妊娠疾病的发生风险提供科学指导，同时为孕妇提供个体化的干预措施。