lnc RNA H19和SIRT6在胃癌中的表达及与预后的关系

彭代笠 何毅明 苏晟田 李远发

胃癌(gastric carcinoma)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是我国成人最为常见的恶性肿瘤，我国每年新增约50万胃癌患者，占全球的1/3，略高于发达国家(4%～5%)[1,2]。胃癌发病男女比约为3∶1，女性年发病率为2.8%，男性年发病率为8.5%，发病年龄高峰为40～60岁，由于幽门螺杆菌的感染、工作压力增大、饮食结构的改变，胃癌呈现年轻化倾向[2]。胃癌早期无明显症状，但极易转移，预后较差，探讨胃癌的发病机制具有重要的意义[3,4]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lnc RNA)是长度>200个核苷酸的非编码 RNA。研究表明,lnc RNA在剂量补偿效应(dosage compensation effect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用。lnc RNA H19与肿瘤细胞的增殖、浸润、转移有关，能激活miR-101和miR-217，上调牛磺酸调节基因1(TUG1)，从而促进癌细胞的增殖分化[5,6]。SIRT6是NAD+依赖型第Ⅲ类HDAC家族成员，通过乙酰化修饰多种基因的表达，对癌症、心血管疾病、糖尿病具有重要调控作用，研究表明，SIRT6为抑癌基因，其机制与SIRT6调控细胞周期、修复紊乱DNA、影响肿瘤细胞能量代谢途径、促进肿瘤细胞凋亡有关[7-9]。因此，本研究探讨lnc RNA H19和SIRT6在胃癌中的表达及与预后的关系，为胃癌的治疗提供理论及临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011年6月至2015年12月在我院行手术治疗并经病理证实的胃癌患者132例为胃癌组，其中男86例，女46例;年龄47～68岁，平均年龄(56.24±1.28)岁;病程4个月～13年，平均病程(5.13±0.36)年；患者肠化生轻度72例，中度31例，重度29例；异型增生轻度45例，中度49例，重度38例；病变位置：胃体63例，胃窦69例；腺癌98例，鳞癌34例；胃镜下评分，初次评分为29.31～34.28分，平均(32.11±1.89)分。符合美国国家综合癌症网(NCCN)公布的2013 版《Gastric Cancer,Version 2.2013》中的诊断标准[10]。同时取距胃癌组织>5 cm的正常胃黏膜为癌旁组。患者自愿提供正常胃黏膜及胃癌组织标本，分析lnc RNA H19和SIRT6的表达。患者预计生存期均>3 个月，未患有其他肿瘤，术前均未接受放化疗治疗。本研究经医院伦理委员会审核通过；患者均知情同意，且签署知情同意书。

1.2 lnc RNA H19和SIRT6 mRNA水平测定 获取正常胃黏膜及胃癌组织总lnc RNA H19和SIRT6 mRNA，测定浓度和纯度，参照GenBank 数据库，设计待测基因位点的PCR 扩增引物和单碱基延伸引物，按20 μl模板和50 μl反应液构成 PCR反应体系，扩增程序：95℃ 5 min;93℃10 s，61℃ 30 s，重复40个循环，61℃时采集荧光。实时荧光定量 PCR仪检测其表达量。见表1、2。

表1 lnc RNA H19、SIRT6引物序列

1.3 免疫组化法测定lnc RNA H19和SIRT6在正常胃黏膜及胃癌组的表达水平 常规制作免疫组化切片。阅片采用双盲法，lnc RNA H19和SIRT6蛋白主要定于细胞核，呈黄色或棕黄色，无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，同时计数；>50%为(+++)，26%～50%为(++)，6%～25%为(+)，阳性细胞≤5% 为 (-)，(-)及(+)为不表达组或低表达组即阴性，(++)及(+++)为高表达组即阳性。

2 结果

2.1 2组lnc RNA H19、SIRT6 mRNA表达水平比较 胃癌组lnc RNA H19 mRNA表达水平高于癌旁组、SIRT6 mRNA表达水平低于癌旁组(P<0.05)。见表3。

表3 2组lnc RNA H19、SIRT6 mRNA表达水平比较

2.2 lnc RNA H19、SIRT6在2组中的免疫组化阳性率比较 lnc RNA H19、SIRT6呈黄色或深棕黄色颗粒，定于细胞核；胃癌组lnc RNA H19阳性102例、SIRT6阳性98例，胃癌组lnc RNA H19阳性率高于癌旁组，SIRT6阳性率低于癌旁组(P<0.05)。见表4，图1。

表4 lnc RNA H19、SIRT6在2组中的免疫组化阳性率比较 n=132,例(%)

图1 lnc RNA H19、SIRT6在癌旁组、胃癌组的表达(免疫组化×200)；A:lnc RNA H19在癌旁组中表达; B:lnc RNA H19在胃癌组中表达;C:SIRT6在癌旁组中表达; D:SIRT6在胃癌组中表达

2.3 lnc RNA H19、SIRT6蛋白表达与临床病理特征的关系 lnc RNA H19、SIRT6蛋白表达与年龄无相关性(P>0.05)；与淋巴血管间隙浸润、病理学分级、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度、复发、肿瘤最大径相关性明显(P<0.05)。见表5。

表5 lnc RNA H19、SIRT6蛋白表达与临床病理特征的关系 n=132,例(%)

2.4 lnc RNA H19、SIRT6蛋白表达水平与胃癌患者预后分析 lnc RNA H19阴性组3年生存率及生存期均明显高于lnc RNA H19阳性组,SIRT6阳性组3年生存率及生存期均明显高于SIRT6阴性组(P<0.05)。见表6,图2。

表6 lnc RNA H19、SIRT6蛋白表达水平与胃癌患者预后分析

图2 lnc RNA H19、SIRT6阳性、阴性Kaplan-Meier生存曲线分析

3 讨论

lnc RNA 是基因转录过程中附加产生的无编码蛋白质功能的基因产物，其长度约为200个核苷酸序列。研究发现lnc RNA在各种肿瘤中异常表达，可作为原癌基因或抑癌基因，是肿瘤潜在的靶治疗点以及预后标志物[11]。lnc RNA H19为表观遗传学分子，其通过高度甲基化印迹控制区第 6个CTCF的结合位点(the sixth CTCF binding site,CBS6)，导致IGF2 基因的印迹缺失，诱导IGF2 高表达,从而使得癌细胞恶性增殖、分化转移[12,13]。原癌基因c-fos、cyclin E、c-Jun、c-Myc、Aurora-A均为Notch lnc RNA H19作用底物，其可促进c-fos、cyclin E、c-Myc、c-Jun、Aurora-A的表达，而上述原癌基因的过表达，往往意味着细胞恶性转化、以及癌细胞的增殖分化[14,15]。本研究结果显示，胃癌组lnc RNA H19 mRNA表达水平高于癌旁组(P<0.05)，胃癌组lnc RNA H19阳性率高于癌旁组(P<0.05)；说明lnc RNA H19在胃癌中高表达，为原癌基因，与上述讨论符合。此外，lnc RNA能通过TGFβ/Smads 信号转导通路，抑制TGF-β1的表达，使得癌细胞逃逸TGF-β1的生长抑制；此外lnc RNA与酪氨酸受体形成异源二聚化，促进自身磷酸化，激活大量下游促癌因子如血管内皮生长因子(VEGF)、白介素-2、6(IL-2、6)、肿瘤坏死因子(TNF)等的表达，进而促进肿瘤的增殖、侵袭和转移[16]。本研究中，lnc RNA H19蛋白表达与年龄相关性不明显;与淋巴血管间隙浸润、病理学分级、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度、复发、肿瘤最大径相关性明显，且有淋巴血管间隙浸润、病理学分期越高、TNM分期越高、有淋巴结转移、浸润深度越深、有复发、肿瘤最大径≥5 cm,lnc RNA H19蛋白阳性表达率越高,说明lnc RNA H19具有促进胃癌发生、发展、侵袭、迁移的生物学功能。

SIRT6基因是抑癌基因，其目标底物E2F1在DNA损伤或致癌信号影响下具有増加S期细胞数量和抑制调亡的作用，SIRT6能去乙酰化E2F1，降低E2F1表达水平，提示SIRT6可作为抑癌因子抑制肿瘤的发生[17]。此外SIRT6其编码蛋白的NADPH结合域能靶定位醇、酚、醌等羟基化合物并与其结合域形成同源二聚体，形成羟基化合物-NADPH- SIRT6蛋白，而此SIRT6二聚体的C-末端的域会招募结合酶(Cdc34、Ubc4、E2)催化向底物分子蛋白转移，进行P-450还原化[18]。若SIRT6表达过低，还原酶P-450活性降低，还原化过程受阻，而Akt/RAS/MEK/ERK信号通路激活，细胞增殖、凋亡、分化、转移及损伤修复功能紊乱，导致细胞恶性转化[19]。本研究中，胃癌组SIRT6 mRNA表达水平低于癌旁组(P<0.05)，胃癌组SIRT6阳性率低于癌旁组(P<0.05)，说明在胃癌中，SIRT6基因是抑癌。有研究表明，乳腺癌及卵巢癌患血清SIRT6降低，而BRCA1水平升高，进一步发现患者血清调亡抑制survivin水平下调，提示低水平的SIRT6能乙酰化survivin启动子H3K9,导致细胞恶性转化；此外，SIRT6低表达可激活WNT信号通路，将细胞质中的β-catenin主动转运至细胞核中，与TCF/LEF的同源异构区域结合，导致靶基因过度表达，进而导致细胞凋亡机制失衡，细胞大量增殖，侵袭和转移[20]。本研究中,SIRT6蛋白表达与年龄相关性不明显;与淋巴血管间隙浸润、病理学分级、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度、复发、肿瘤最大径相关性明显，且有淋巴血管间隙浸润、病理学分期越高、TNM分期越高、有淋巴结转移、浸润深度越深、有复发、肿瘤最大径≥5 cm,SIRT6蛋白阳性表达率越低，说明SIRT6具有抑制胃癌发生、发展的作用。

此外，本研究还发现，lnc RNA H19阴性组3年生存率及生存期均明显高于lnc RNA H19阳性组,SIRT6阳性组3年生存率及生存期均明显高于SIRT6阴性组(P<0.05)；说明lnc RNA H19低表达、SIRT6高表达的胃癌患者能获得较好的预后。

综上所述，胃癌患者中lnc RNA H19表达升高、SIRT6表达降低，其与肿瘤增殖、浸润、迁移密切相关；lnc RNA H19低表达、SIRT6高表达的胃癌患者能获得较好的预后。